Induction of reactive oxygen species by mechanical stretch drives endothelin production in neonatal PIg renal epithelial cells

Keywords: Acute kidney injury; Endothelin; Endothelin converting enzyme; Hydrogen peroxide; Mechanical stretch; Neonatal pigs; Urinary tract obstruction.

從腎臟到尿道的尿路梗阻是嬰兒腎損傷的重要原因。長期梗阻可能發展為嚴重的腎臟炎癥、纖維化和慢性腎病。尿路梗阻導致腎內皮素（ET）1 水平升高，提示腎臟 ET1 可能導致梗阻性腎病。ET有三種不同的異構體（ET1、ET2和ET3）。血管活性 ET 異構體是由 ET 轉化酶（ECE）誘導的前分子大 ET 蛋白水解加工為生物活性肽產生的。ECE1 主要在腎小管區域表達。H2O2是一種活性氧（ROS），可反式激活 ECE1 的啟動子并增加其水平。尿路梗阻導致顯著的 ROS 生成和腎小管細胞的伸展。研究還表明，機械拉伸是細胞氧化還原信號傳導的有效驅動因素，但腎小管細胞拉伸是否刺激 ROS 和下游 ET 的產生尚未明確。

ET 同源受體（ETR）與 G 蛋白偶聯，它們的刺激導致平滑肌細胞（SMC）離子通道激活并隨之控制細胞內 Ca2+（[Ca2+]i）水平和血管反應性。ET1 通過激活平滑肌細胞TRPC3 收縮腦動脈，但血管調節的基礎機制存在區域異質性。研究表明，TRPC3 介導新生豬腎微血管 SMC 中的受體操縱的鈣內流（ROCE）。然而，盡管對其他血管床進行了大量工作，但腎微血管 SMC 中 TRP 通道的病理生理學知之甚少。

嚙齒類動物梗阻性腎病的治療尚未轉化為人類的成功臨床結果。因此，需要新的途徑和動物模型來確定梗阻性急性腎損傷（AKI）的早期機制和新的治療靶點，以防止嬰兒腎損失。然而，由于人類和豬的腎臟系統在解剖和功能上相似，豬模型可能比嚙齒動物更能模擬人類梗阻性腎病的病理生理學。機械拉伸培養的腎上皮細胞是單側輸尿管梗阻（UUO）誘導的腎小管應激的體外模型。

基于此，美國田納西大學健康科學中心醫學院生理學系團隊在一項研究中使用了新生豬腎上皮細胞系和短期 UUO 模型，以驗證拉伸驅動的 ROS 刺激新生兒腎臟中 ET 產生，導致下游腎臟血管收縮的假設。研究成果發表于 Redox Biology 期刊題為“Induction of reactive oxygen species by mechanical stretch drives endothelin production in neonatal pig renal epithelial cells”。
如 f-肌動蛋白免疫染色所示，10% 循環單軸機械拉伸的 LLC-PK1 細胞比未拉伸的細胞更長（圖1 A）。qRT-PCR 顯示，在拉伸的 LLC-PK1 細胞中，NOX2 和 NOX4 mRNAs 分別增加了 4 倍和 2 倍（圖1 B、C）。拉伸后的細胞顯示過氧化氫酶免疫染色顯著降低，細胞 H2O2 增加（圖1 D-F）。拉伸誘導的細胞 H2O2 和ECE1 增加被 EUK（一種超氧化物歧化酶和過氧化氫酶模擬物）逆轉（圖1 F、G）。拉伸細胞中的 ET1-3 水平也增加，而 EUK 和 ECE1 抑制劑 CGS 使其減弱（圖1 H-J）。NOX 抑制劑 apocynin 也減少了拉伸誘導的 ECE1 和 ET1-3 的產生。此外，siRNA 介導的 NOX2 和 NOX4 敲低同樣減弱了拉伸誘導的 ECE1 和 ET1-3。這些數據表明，機械拉伸在 LLC-PK1 細胞中產生 H2O2并誘導 ECE1-依賴性 ET1-3 產生。

圖1 機械拉伸在 LLC-PK1 細胞中產生 H2O2并誘導 ECE1-依賴性 ET1-3 產生。

阻塞左輸尿管 3 小時后恢復 3 小時，未導致新生豬出現明顯的形態性腎損傷。然而，急性可逆性 UUO（rUUO）增加了豬尿異前列腺素（腎氧化應激標志物）和 H2O2水平，但降低過氧化氫酶的免疫染色。IHC 顯示，ECE1 在腎小管中表達，其被 rUUO 擴增。 rUUO 后 mRNA 表達、腎組織中的酶活性和尿液 ECE1 的水平高于對照組。rUUO 豬的腎小管免疫染色和 ET1-3 水平升高，而CGS 逆轉了這一點。這說明，急性可逆性 UUO 刺激新生豬腎臟中 H2O2產生和 ECE1-依賴性 ET1-3 產生。

在沒有細胞外 Ca2+ 的情況下，ET 沒有增加新生豬入球小動脈中 [Ca2+]i 水平（圖2 A、B）。細胞外 Ca2+ 的恢復導致 ET 誘導的 [Ca2+]i 增加約150 nM（圖2 A、B）。ROCE 激活劑 DAG 類似物 OAG 顯著升高微血管中的 [Ca2+]i，選擇性 TRPC3 阻斷劑 Pyr3 則減弱 [Ca2+]i（圖2 C、D）。盡管尼莫地平阻斷L-型電壓門控式Ca2+ 通道（L-VGCC），他普西加金耗竭細胞內 Ca2+ 貯存，但激活 ETR還是能夠提高 [Ca2+]i水平（圖2 E、F）。雖然選擇性 TRPC6 通道阻滯劑 SAR 7334 沒有效果，但 Pyr3 基本上消除了 ET1 誘導的 ROCE。將 ET1-3 直接輸注到腎臟中以盡量減少其全身影響，導致腎皮質灌注和總腎血流量（tRBF）減少，腎血管阻力（RVR）增加，而這些被 Pyr3 減弱。這些數據表明，ET 受體（ETR）的激活觸發了入球小動脈平滑肌細胞中受體操控式Ca2+ 內流（ROCE），并通過 TRPC3 通道導致腎臟灌注不足。

圖2 ET 受體（ETR）的激活觸發了入球小動脈平滑肌細胞中ROCE。

此外，結果顯示，假手術豬的 tRBF 和 RVR 保持不變。相比之下，在 UUO 期間，tRBF 降低，RVR 增加，并且盡管去除了阻塞，但仍未恢復。用 CGS、ETR 拮抗劑波生坦和 pyr3 處理則逆轉了 rUUO 誘導的 tRBF 降低和 RVR 增加。這說明，rUUO 通過激活 ECE1/ETR/TRPC3引起腎臟灌注不足。

從新生豬腎微血管中分離的蛋白，用抗-ETRA、ETRB和TRPC3抗體進行Western blot檢測，結果顯示急性rUUO豬體內這些蛋白的表達沒有改變（圖3 A-C）。rUUO 增加了尿液早期 AKI 生物標志物 NGAL、L-FABP 和 IL-18 的水平（圖3 D-F）。rUUO 誘導的這些生物標志物的增加被 CGS、波生坦和 Pyr3 逆轉（圖3 D-F）。這些數據表明，rUUO 未改變 ETR和 TRPC3 的蛋白表達水平，但通過激活 ECE1/ETR/TRPC3 信號誘導早期 AKI。

圖3 rUUO 未改變 ETR和 TRPC3 的蛋白表達水平，但通過激活 ECE1/ETR/TRPC3 信號誘導早期 AKI。

圖4 機械拉伸通過誘導多種 ET 異構體的 ROS-依賴性生物合成和血管 SMC ET 受體和 TRPC3 通道的連續激活，損害新生豬微循環并促進早期腎功能不全的假設途徑。

盡管先前的研究表明，新生兒尿路梗阻會增加腎臟 ET1 水平，但對梗阻腎臟中的拉伸應力-ET 分子的聯系知之甚少。這項研究提供了新的數據，表明拉伸驅動的氧自由基刺激新生豬腎上皮細胞中所有 ET 異構體的產生。ET 激活腎血管 SMC TRPC3，導致持續性血管收縮和 RVR 增加。這些機制可能導致尿路梗阻引起的新生兒 AKI 的早期血管變化。

參考文獻：Kumar R, Soni H, Afolabi JM, Kanthakumar P, Mankuzhy PD, Iwhiwhu SA, Adebiyi A. Induction of reactive oxygen species by mechanical stretch drives endothelin production in neonatal pig renal epithelial cells. Redox Biol. 2022 Sep;55:102394. doi: 10.1016/j.redox.2022.102394. Epub 2022 Jul 4. PMID: 35841629; PMCID: PMC9289874.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35841629/

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Online ISSN: 2213-2317

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