在抗體偶聯(lián)藥物（Antibody - drug conjugates，ADC）的復(fù)雜體系中，抗體內(nèi)化是 ADC 藥物發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。抗體作為 ADC 藥物的重要組成部分，其內(nèi)化能力直接影響藥物療效與安全性。

一、抗體內(nèi)化的分子機(jī)制與途徑探索

1.抗體內(nèi)化的本質(zhì)與細(xì)胞旅程
抗體內(nèi)化，即抗體內(nèi)吞，指細(xì)胞表面抗體與對(duì)應(yīng)抗原結(jié)合后，借助細(xì)胞自身運(yùn)輸體系，將抗體 - 抗原復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)部并發(fā)揮特定生物學(xué)功能的過(guò)程。大多數(shù) ADC 藥物分子以此方式進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性效應(yīng)。常規(guī)內(nèi)吞作用一般分為芽形成、膜彎曲與囊泡成熟、膜分裂并釋放至細(xì)胞質(zhì)三個(gè)階段，為抗體內(nèi)化提供了基本細(xì)胞生理基礎(chǔ)。

2.ADC 藥物內(nèi)化途徑的精細(xì)分類
對(duì)已上市 ADC 藥物內(nèi)化方式的研究表明，其內(nèi)化途徑依據(jù)是否依賴網(wǎng)格蛋白，可分為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）與網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用兩類。其中，網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞作用又進(jìn)一步細(xì)分為小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白 / GPI 錨定蛋白富集的早期內(nèi)體區(qū)室（CLIC/GEEC）和巨胞飲作用。

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用是 ADC 藥物內(nèi)吞的重要途徑，其過(guò)程包含一系列緊密相連且部分重疊的步驟。不同受體觸發(fā) CME 的機(jī)制存在差異，既可以由質(zhì)膜上某些受體組成型啟動(dòng)，也能通過(guò)受體與配體和 / 或抗體結(jié)合來(lái)開(kāi)啟。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)吞衣殼蛋白開(kāi)始在質(zhì)膜內(nèi)小葉聚集時(shí)，CME 起始。衣殼蛋白通過(guò)募集細(xì)胞質(zhì)中的額外接頭蛋白并與之相互作用，持續(xù)組裝與生長(zhǎng)。關(guān)鍵銜接蛋白促使膜彎曲，將內(nèi)化受體 / 配體聚集到 “網(wǎng)格蛋白包被坑”（CCP）中。隨著 CCP 內(nèi)陷加深，其頸部收縮，通過(guò)斷裂過(guò)程與質(zhì)膜分離。肌動(dòng)蛋白聚合助力 CCP “向內(nèi)” 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，直至分裂完成，CCP 轉(zhuǎn)變?yōu)榫W(wǎng)格蛋白包被的囊泡（CCV）。最終，CCV 外殼解體，CCV 與內(nèi)體融合并分選至特定亞細(xì)胞位置，或者循環(huán)回到細(xì)胞表面。這一過(guò)程的各步驟精確有序，確保了抗體內(nèi)化的高效進(jìn)行。

二、影響抗體內(nèi)化的多元因素剖析

1.靶點(diǎn)
抗體能否被內(nèi)化，靶點(diǎn)起決定性作用。不同靶點(diǎn)具有特定結(jié)構(gòu)，只有與之匹配的抗體才能啟動(dòng)內(nèi)化進(jìn)程。而抗體內(nèi)化效率受多方面因素綜合影響。

2.抗體自身特性的影響
抗體的親和力與特異性對(duì)其內(nèi)化有重要影響。親和力高的抗體與抗原結(jié)合能力強(qiáng)，為內(nèi)化提供動(dòng)力；特異性高的抗體能精準(zhǔn)識(shí)別抗原，避免非特異性結(jié)合，確保內(nèi)化的準(zhǔn)確性與高效性。

不同類型和亞型的抗體，通過(guò)不同的受體和信號(hào)通路影響內(nèi)化速度與效率。例如，IgG 和 IgA 內(nèi)化速度相對(duì)較快，而 IgM 和 IgE 內(nèi)化速度較慢，這反映了不同抗體在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制上的差異。

抗體的劑量和濃度對(duì)其內(nèi)化呈 “雙刃劍” 效應(yīng)。劑量和濃度增加，抗體與抗原結(jié)合機(jī)會(huì)增多，內(nèi)化可能性增大；但過(guò)高劑量和濃度可能導(dǎo)致受體飽和或下調(diào)，降低內(nèi)化效果。

3.細(xì)胞因素的影響
不同類型細(xì)胞的受體表達(dá)和內(nèi)化能力不同。B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)化能力較強(qiáng)，T 細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)化能力較弱，這種天然差異顯著影響抗體內(nèi)化效果。

細(xì)胞狀態(tài)是影響內(nèi)化動(dòng)力學(xué)的重要因素。活化細(xì)胞內(nèi)化速度較快，凋亡細(xì)胞內(nèi)化速度顯著減慢。此外，分子量較大的抗原通常更難被細(xì)胞內(nèi)化；針對(duì)同一靶點(diǎn)的不同抗體，因結(jié)構(gòu)等因素也會(huì)展現(xiàn)出不同的內(nèi)化效率。因此，在 ADC 藥物研發(fā)中，篩選高內(nèi)化效率的抗體對(duì)確保藥物安全性與有效性至關(guān)重要。

三、抗體內(nèi)化檢測(cè)技術(shù)的全景透視

1.基于活細(xì)胞成像的內(nèi)化檢測(cè)
基于活細(xì)胞成像的內(nèi)化檢測(cè)（Incucyte），通過(guò)實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像儀對(duì)裸抗進(jìn)行藥效動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。與傳統(tǒng)終點(diǎn)檢測(cè)不同，它采用多濃度點(diǎn)、多時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)模式，可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)達(dá) 72 小時(shí)的連續(xù)觀察。這種動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)方式為深入了解抗體內(nèi)化過(guò)程提供了豐富時(shí)間序列數(shù)據(jù)，是研究抗體內(nèi)化的有力工具。

2.基于毒素偶聯(lián)的殺傷檢測(cè)
基于毒素偶聯(lián)的殺傷檢測(cè)主要包括 DT3C 法與 Mab - ZAP 方法。這兩種方法均利用抗體 - 毒素復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)釋放毒素引發(fā)細(xì)胞毒性的原理，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞殺傷情況評(píng)估抗體的內(nèi)化效果。DT3C 是 2014 年 MikiYamaguchi 等人利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的重組蛋白，由無(wú)受體結(jié)合域的白喉毒素（DT）和鏈球菌蛋白 G 的 C1、C2、C3（3C）結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；Mab - ZAP 由小鼠抗體和核糖體失活蛋白皂草素組成。相較于傳統(tǒng)的 Mab - ZAP 方法，DT3C 法中的 mAb - DT3C 偶聯(lián)物具有分子量更穩(wěn)定、內(nèi)化效率更高、適用性更廣、成本更低等優(yōu)勢(shì)，為抗體內(nèi)化檢測(cè)提供了更優(yōu)化選擇。

3.基于 pH 探針與溫度轉(zhuǎn)變的內(nèi)化檢測(cè)
基于 pH 探針的內(nèi)化檢測(cè)與基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測(cè)是細(xì)胞內(nèi)化過(guò)程檢測(cè)的常用方法。基于 pH 探針的內(nèi)化檢測(cè)利用熒光探針對(duì) pH 值的敏感性，通過(guò)反映細(xì)胞內(nèi)囊泡的酸化程度判斷內(nèi)化進(jìn)程與位置；基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測(cè)利用熒光二抗在不同溫度下熒光強(qiáng)度的變化，區(qū)分細(xì)胞內(nèi)外的熒光信號(hào)，進(jìn)而判斷內(nèi)化效率與程度。

不過(guò)，這兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。基于 pH 探針的內(nèi)化檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，熒光信號(hào)清晰且可定量分析，適用于高通量篩選，但需精準(zhǔn)選擇合適的 pH 敏感探針，并應(yīng)對(duì)其可能受到的多種干擾因素；基于溫度轉(zhuǎn)變的熒光二抗內(nèi)化檢測(cè)則需精確控制溫度變化，同時(shí)要考慮不同熒光二抗的溫度敏感性差異以及溫度轉(zhuǎn)變對(duì)細(xì)胞生理狀態(tài)和內(nèi)化動(dòng)力學(xué)的潛在影響。

產(chǎn)品信息


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