文獻信息
北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所，核醫學科，國家藥監局放射性藥物研究與評價重點實驗室，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室的研究成果Novel Peptide-Based ⁶⁸Ga-Labeled Radiotracer for Preclinical Studies of TIM3 Expression（新型肽基⁶⁸Ga標記放射性示蹤劑用于TIM3表達的臨床前研究）在學術期刊《MOLECULAR PHARMACEUTICS》發表。平生公司的小動物PET/CT（型號：Super Nova）產品在論文中提供了重要的腫瘤小鼠PET/CT圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為北腫朱華研究員、趙傳科副研究員。第一作者為陶金萍同學，王菲大夫。

陶金萍，王菲，曾子晴，周文媛，王紫蕾，何成雪，朱錦玉，趙傳科，朱華

文獻背景
T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域-3（TIM3）是一種免疫檢查點，在免疫反應中起負調控作用。TIM3靶向藥物抑制這種負調控，從而調節免疫反應激活的水平。在之前的研究中，通過噬菌體肽庫篩選鑒定出了幾種靶向TIM3的肽。本研究根據靶向TIM3藥物會導致干擾素-γ（IFN-γ）分泌增加的特點，選擇了三種肽構建放射性分子探針。進行分子對接以評估所選肽與TIM3蛋白的結合特性。為了進一步增強靶向特性，對其中一種具有較高親和力的肽進行了結構修飾。然后，通過用⁶⁸Ga核糖探針標記六種肽，使用⁶⁸Ga構建肽探針⁶⁸Ga-DOTA肽，并使用TIM3過表達細胞系A549^TIM3和親本A549細胞評估結合親和力和特異性。此外，在Micro-PET/CT成像中，通過尾靜脈注射3.7-7.4MBq ⁶⁸Ga-DOTA肽后，對轉染模型小鼠進行動態成像30分鐘。同時，在MC38模型（小鼠中的癌癥）和CCRCC（透明細胞腎細胞癌）異種移植模型中注射相同劑量的分子探針，然后在注射后15、30和60分鐘進行靜態掃描。最后，進行免疫組織化學（IHC）染色以評估TIM3在解剖的腫瘤組織中的表達。分子對接結果表明，P26與TIM3蛋白的結合能為-6.5 kcal/mol，低于P24與TIM3蛋白質的結合能-3.6 kcal/mol。對P26肽進行結構修飾后，獲得P26NH₂、r-NH₂和P26X₂，并通過⁶⁸Ga標記將上述肽成功構建成6個靶向TIM3肽探針。細胞攝取實驗表明，⁶⁸Ga-DOTA-P26、⁶⁸Ga-DODA-P26NH₂和⁶⁸Ga-DOTA-r-NH₂在A549^TIM3細胞中的攝取明顯高于A549細胞，并且可以被未標記的肽阻斷。Micro-PET成像實驗表明，每種探針在A549^TIM3模型腫瘤組織中的攝取量明顯高于A549模型腫瘤組織，對各組腫瘤與心臟攝取率的比較表明，⁶⁸Ga-DOTA-P26在A549^TIM3模型中的腫瘤與心臟的攝取率優于其他幾種分子探針，在MC38模型中也得到了類似的結果，但不同的是，⁶⁸GaDOTA-P26NH₂在CCRCC模型中的瘤心攝取率最高。最后，IHC的驗證表明，A549^TIM3、MC38和CCRCC腫瘤組織具有不同程度的TIM3表達。通過比較離體和體內研究，其中一種⁶⁸Ga-DOTA-P26探針對TIM3表現出顯著的靶特異性。這些結果表明，研究靶向TIM3的肽探針將促進TIM3靶向藥物研究的進程，并有望指導TIM3免疫檢查點藥物在免疫治療中的應用。

實驗方法
微PET成像研究
通過皮下注射3×10⁶ MC38細胞在C57BL/6J小鼠中建立MC38模型，通過皮下注射1×10⁶A549^TIM3和A549細胞建立BALB/c裸鼠模型，通過在NOD SCID小鼠中皮下接種CCRCC患者的腫瘤組織塊構建CCRCC模型。當腫瘤體積達到100-300mm³時，使用小鼠進行成像。對于靜態成像，MC38腫瘤模型和CCRCC腫瘤模型通過尾靜脈注射7.4 MBq的⁶⁸Ga-DOTA-P26、⁶⁸Ga-DODA-P24、⁶⁸Ga-TOTA-P20、⁶⁸Ga-DOTA-P26NH₂、⁶⁸Ga-OTA-r-NH₂和⁶⁸Ga-DOTA-P26X₂，并在15、30和60分鐘時使用微型PET掃描儀采集600秒的圖像。重建圖像，繪制感興趣區域（ROI），并將定量數據表示為每克組織注射劑量的百分比（%ID/g）。

使用微型PET/CT進行動態成像研究

A549和A549^TIM3荷瘤小鼠經尾靜脈注射約7.4 MBq ⁶⁸Ga-DOTA肽，然后立即進行動態Micro-PET/CT成像60分鐘，然后進行高分辨率CT（計算機斷層掃描）掃描以供解剖參考。PET數據被重建為10分鐘、20分鐘和30分鐘。結果表示為每克組織注射劑量的百分比（%ID/g）。

實驗結果
A549/A549^TIM3模型中⁶⁸Ga-DOTA肽的微PET/CT成像。使用六肽放射性探針在A549和A549^TIM3荷瘤小鼠中進行了微PET/CT成像。給藥后用2%異氟烷進行麻醉，然后在微型PET/CT（Super Nova PET/CT，平生醫療科技有限公司）上完成30分鐘的動態掃描，并獲得微型PET/CT最大強度投影圖像，如圖4A所示。在A549^TIM3小鼠的成像中，在注射放射性肽探針后10分鐘觀察到清晰的成像結果，這些探針在30分鐘內從體內迅速代謝。除了⁶⁸Ga-DOTA-P24探針在A549和A549^TIM3腫瘤小鼠中的攝取值沒有顯著差異（圖4C）外，其他⁶⁸Ga-DOTA肽在A549^TIM3和A549腫瘤中的攝取量在10分鐘時存在顯著差異（⁶⁸Ga-DODA-P26:1.39±0.022%ID/g vs 1.01±0.012%ID/g；⁶⁸Ga-DOA-P20:1.74±0.017%ID/g vs 1.05±0.021%ID/g；⁶⁸Ga-DOTA-P26NH₂：1.93±0.024%ID/g vs 1.70±0.008%ID/g；⁶⁸Ga-DOTA-rNH₂:1.81±0.017%ID/g vs1.64±0.029%ID/g；⁶⁸Ga-DOT A-P26X₂:1.18±0.024%ID/g vs1.59±0.033%ID/g ；p>0.01）（圖4B，D-G）；然而，A549腫瘤對⁶⁸Ga-DOTA-P26X₂的攝取高于A549^TIM3，這表明⁶⁸Ga-DOTA-P26X₂在體內對TIM3沒有明顯的靶向作用。注射后10分鐘六肽放射性示蹤劑的圖像清楚地顯示，很大一部分放射性示蹤劑在腎臟中積聚，表明示蹤劑在腎臟代謝，其余部分分布在心血池和腫瘤部位（圖4A）。

圖4 腫瘤模型中的微PET/CT成像。（A） 注射⁶⁸Ga-DOTA肽探針后10分鐘、20分鐘和30分鐘，用Micro-PET/CT對A549/A549^TIM3異種移植物模型進行成像，白色箭頭表示腫瘤已定位。（B） 注射⁶⁸Ga-DOTA-P26后不同時間點A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g；（C） 注射⁶⁸Ga-DOTA-P24后不同時間點A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g；（D） 注射⁶⁸GaDOTA-P20后不同時間點A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g；E： 注射⁶⁸Ga-DOTA-P26NH₂后不同時間點A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g；（F） 注射⁶⁸Ga-DOTA-r-NH2后不同時間點A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g；以及（G）注射⁶⁸Ga-DOTA-P26X₂后不同時間點A549/A549^TIM3模型小鼠各器官的ID%/g。

文獻結論
在這項研究中，作者開發了各種新的肽分子探針，用于TIM3表達的特異性微PET/CT成像。在深入分析P26、P24和P20肽與TIM3蛋白之間的結合模式后，通過選擇對TIM3具有高親和力的P26肽并將其酰胺化進行結構修飾，獲得了三種肽，即P26NH ₂ 、r-NH ₂ 和P26X ₂ 。體外實驗證實， ⁶⁸ Ga-DOTA-P26、 ^{6 8} Ga-DODA-P26NH ₂ 和 ⁶⁸ Ga-DOTA-r-NH ₂ 探針對TIM3表現出高度的特異性和親和力。然而，在微PET/CT成像實驗中， ⁶⁸ Ga-DOTA-P26的腫瘤與心臟攝取率在多種模型中均優于其他肽探針。總之，本研究確定 ⁶⁸ Ga-DOTA-P26是一種有前景的靶向TIM3的肽成像劑，突出了其在該領域的潛力和新的可能性。

使用設備

                                                 Super Nova^? Micro PET/CT（III 代外觀圖）