腦類(lèi)器官使得人類(lèi)大腦發(fā)育的機(jī)制研究成為可能，并提供了在不受限制的發(fā)育系統(tǒng)中探索自我組織形成的機(jī)會(huì)， 類(lèi)器官的成像觀察是理解其微觀結(jié)構(gòu)和功能的重要手段（文獻(xiàn)1）。由于人腦類(lèi)器官的尺寸較大，組織致密，發(fā)育緩慢，且在幾周到幾個(gè)月的發(fā)育過(guò)程中需要無(wú)菌成像條件，使得對(duì)人腦類(lèi)器官的活體成像特別是長(zhǎng)時(shí)間，面臨巨大挑戰(zhàn)。

在本例中，作者 建立了長(zhǎng)期的活體光片顯微鏡技術(shù)，應(yīng)用于由熒光標(biāo)記的人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成的無(wú)指導(dǎo)腦類(lèi)器官，這使得我們能夠在類(lèi)器官發(fā)育的數(shù)周內(nèi)跟蹤組織形態(tài)、細(xì)胞行為和亞細(xì)胞特征，為研究人類(lèi)大腦形態(tài)動(dòng)力學(xué)提供了新的途徑，并支持基質(zhì)相關(guān)的機(jī)械感知?jiǎng)討B(tài)在大腦區(qū)域化過(guò)程中發(fā)揮核心作用的觀點(diǎn)。

稀疏和多位點(diǎn)熒光標(biāo)記腦類(lèi)器官的
長(zhǎng)期活體成像

01、類(lèi)器官的培養(yǎng)
本研究中使用的細(xì)胞系為：

Histone2B-mEGFP 均勻標(biāo)記細(xì)胞核
mEGFP-Beta-Actin 均勻標(biāo)記 ACTB
mTagRFP–T–CAAX 標(biāo)記細(xì)胞膜
mTagRFP–T-LaminB1 標(biāo)記 LMNB1
未標(biāo)記的 WTC iPSCs

操作流程：

• 干細(xì)胞系按標(biāo)準(zhǔn)流程培養(yǎng)和傳代
• 96孔板，每孔加入500個(gè)細(xì)胞/3000個(gè)細(xì)胞，在 mTSR+中（加入1:200 ROCKi和1:200Pen-strep），并以 200g離心5分鐘以生成胚體（EBs）
• 在第 2 天更換新鮮的 mTSR+，加入1:200 ROCKi 和 1:200 Pen-strep
• 第 4 天提供含 2%溶解的 matrigel 的新鮮神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并每隔一天更換一次
• 第 10 天提供含 2% matrigel 的分化培養(yǎng)基-VitA，并在第 15 天提供含 1% matrigel 的分化培養(yǎng)基+ VitA
• 第 15 天將類(lèi)器官轉(zhuǎn)移到 24 孔板中，每孔一個(gè)類(lèi)器官，并轉(zhuǎn)移到搖床上，隨后在一個(gè)月時(shí)將每孔一個(gè)類(lèi)器官轉(zhuǎn)移到 6 孔板中，并保持在搖床上
• ?嵌入基質(zhì)膠中，并培養(yǎng)在樣本室微孔中的細(xì)胞球用于光片成像

圖1.腦類(lèi)器官培養(yǎng) a)本研究開(kāi)發(fā)的流程示意圖（流程I）和之前的多區(qū)域人腦類(lèi)器官（流程II）b)在兩種細(xì)胞接種濃度下，聚集后第4天類(lèi)器官大小的比較，比例尺為500μm c)顯示在兩種不同的流程下，第8-11天類(lèi)器官生長(zhǎng)的名稱(chēng)圖像 d)樣品保持室的照片，包含四個(gè)分隔的子室，每個(gè)子室有四個(gè)微孔，用于生長(zhǎng)和成像16個(gè)不用的類(lèi)器官，每個(gè)微孔一個(gè)。

02、長(zhǎng)期活體成像觀察

胚胎體（4 個(gè)）嵌入溶解在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的 20-50%基質(zhì)膠中或覆蓋在 0.6%的低熔點(diǎn)瓊脂糖上。

圖2.稀疏和多位點(diǎn)熒光標(biāo)記腦類(lèi)器官的長(zhǎng)期活體成像.f、4 個(gè)不同類(lèi)器官（第 15 天）的 3D 投影（左）和橫截面（右），用全切片熒光原位雜交鏈反應(yīng)（HCR）染色標(biāo)記轉(zhuǎn)錄本。比例，100 微米。g) 從 188 小時(shí)成像實(shí)驗(yàn)中 75 小時(shí)成像的最大投影圖像。類(lèi)器官包含 5 種不同的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系具有穩(wěn)定的蛋白質(zhì)遺傳標(biāo)記，使用紅色或綠色熒光蛋白（RFP，GFP），以及未標(biāo)記的細(xì)胞。比例，100 微米。h) 組織器切片（84 小時(shí)）顯示核膜（Lamin，RFP，品紅色）、質(zhì)膜標(biāo)記（CAAX，RFP，品紅色）、肌動(dòng)蛋白（GFP，綠色）、微管蛋白（RFP，品紅色）和細(xì)胞核（組蛋白，GFP，綠色）。i) 不同時(shí)間點(diǎn)的圖像顯示最大強(qiáng)度投影（左半部分）和切片（右半部分）。

每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。成像使用 Viventis LS1 Live 光片顯微鏡進(jìn)行，具體設(shè)置如下：

• 物鏡——25X NA1.1水鏡
• 成像視野——710μm
• xy 像素大小——0.347μm
• Z軸步徑——2μm，201 步
• ?采集幀率為——30 分鐘 

外源性細(xì)胞外基質(zhì)影響大腦類(lèi)
器官的形態(tài)發(fā)生

為了量化類(lèi)器官之間的形態(tài)動(dòng)態(tài)變化，作者利Viventis LS2光片顯微鏡低光毒性、多位點(diǎn)、多視角的成像能力，一次成像并行記錄16個(gè)類(lèi)器官通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析不同時(shí)間點(diǎn)類(lèi)器官體積、腔室體積和腔室數(shù)量，結(jié)果突出了早期大腦類(lèi)器官發(fā)育的三個(gè)形態(tài)動(dòng)力學(xué)階段，包括：

快速組織和腔體生長(zhǎng)的早期階段
涉及腔體融合事件的組織穩(wěn)定階段
神經(jīng)上皮成熟的最終階段

對(duì)比用基質(zhì)膠、低熔點(diǎn)瓊脂糖和不使用任何外源基質(zhì)培養(yǎng)類(lèi)器官，使用光片長(zhǎng)時(shí)間跟蹤類(lèi)器官動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示外源細(xì)胞外基質(zhì)的存在對(duì)人腦類(lèi)器官的組織尺度形態(tài)發(fā)生有重大影響，且改變的組織極性可能會(huì)影響成熟神經(jīng)上皮中的細(xì)胞形態(tài)動(dòng)力學(xué)。

 

圖3.外源性細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)大腦類(lèi)器官形態(tài)發(fā)生的影響。a) 類(lèi)器官投影（第 7 天）顯示 16 個(gè)同時(shí)圖像采集，展示核膜（Lamin，RFP，橙色）、質(zhì)膜標(biāo)記（CAAX，RFP，橙色）、肌動(dòng)蛋白（GFP，青色）、微管蛋白（RFP，橙色）和細(xì)胞核（組蛋白，GFP，青色）。最大投影（左）和橫截面（右）b) 來(lái)自同一類(lèi)器官在不同時(shí)間點(diǎn)的靜態(tài)圖，顯示橫截面并突出腔體形態(tài)（虛線）c) 類(lèi)器官的橫截面顯示分段腔體和類(lèi)器官上皮分割圖。d) 第 4-9 天每天測(cè)量的類(lèi)器官總體積e) 圖表顯示隨時(shí)間變化的所有腔體的總體積f) 圖表顯示隨時(shí)間變化的分段腔體總數(shù)的變化。g) 類(lèi)器官的橫截面顯示腔體形成和融合的過(guò)程m) 細(xì)胞外微環(huán)境的示意圖及與之對(duì)應(yīng)的明場(chǎng)圖像，顯示用 Matrigel（外部 ECM）培養(yǎng)的類(lèi)器官、沒(méi)有任何外部嵌入（內(nèi)部 ECM）和低熔點(diǎn)瓊脂嵌入（擴(kuò)散屏障）。n) 示意圖顯示光片實(shí)驗(yàn)設(shè)置，以獲取不同嵌入處理的 16 倍類(lèi)器官的同步成像。o) 第 9 天的圖像靜幀，顯示沒(méi)有任何嵌入和帶有瓊脂擴(kuò)散屏障的類(lèi)器官的最大投影（左）和橫截面（右）。p) 用 Matrigel 培養(yǎng)的類(lèi)器官、沒(méi)有基質(zhì)和帶有擴(kuò)散屏障的類(lèi)器官中分段腔的 3D 渲染。q-r) 圖表顯示從第 4 天到第 9 天每天測(cè)量的所有成像類(lèi)器官的總體積（q）、分段腔的總數(shù)變化（r）以及所有腔的總?cè)萘侩S時(shí)間的變化（s）誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)差。t) 圖像顯示了在使用基質(zhì)膠或無(wú)基質(zhì)生長(zhǎng)的類(lèi)器官（第 15 天）上進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)的橫截面，并染色以顯示細(xì)胞核（DAPI）、COL4A1 和 CDH2。所有圖像的比例尺為 100 μm。

單細(xì)胞形態(tài)類(lèi)型分析揭示了發(fā)育中的
類(lèi)器官內(nèi)形狀的轉(zhuǎn)變

研究人員利用多位點(diǎn)標(biāo)記的質(zhì)膜、肌動(dòng)蛋白、微管、核膜和組蛋白評(píng)估細(xì)胞形態(tài)變化在早期大腦類(lèi)器官發(fā)育過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的影響。通過(guò)開(kāi)發(fā)的圖像分析流程：圖像預(yù)處理→亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分割→結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)→特征提取→解多通道→形態(tài)特征分析，揭示了兩個(gè)主要的核（組蛋白、層粘連蛋白）和細(xì)胞（肌動(dòng)蛋白、微管、膜）結(jié)構(gòu)組。

通過(guò)高分辨率聚類(lèi)，將結(jié)構(gòu)分組為形態(tài)類(lèi)型，即具有相似形態(tài)特征（如體積、曲率、軸長(zhǎng)的細(xì)胞簇，使用PAGA軌跡分析識(shí)別組織中的結(jié)構(gòu)變化梯度，量化了多能干細(xì)胞向早期神經(jīng)外胚層的過(guò)渡，基于細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)和組織拓?fù)渥兓纬沙墒斓纳窠?jīng)上皮。

通過(guò)對(duì)每種基質(zhì)條件（基質(zhì)膠、瓊脂糖和無(wú)外源基質(zhì)）下，對(duì)每一天成像的類(lèi)器官進(jìn)行標(biāo)記結(jié)構(gòu)的分割以及形態(tài)學(xué)分類(lèi)分析，結(jié)果表明在沒(méi)有基質(zhì)膠作為外部細(xì)胞外基質(zhì)的情況下生成的類(lèi)器官在組織拓?fù)渖习l(fā)生了變化，包含更大比例的非排列和非延長(zhǎng)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)類(lèi)型的異質(zhì)性更高，并且未形成均勻的神經(jīng)外胚層和神經(jīng)上皮。

圖4. 使用接多路多位點(diǎn)細(xì)胞標(biāo)簽的細(xì)胞和細(xì)胞核形態(tài)轉(zhuǎn)變。a)分析策略示意圖。b) 第 6 天的類(lèi)器官最大強(qiáng)度投影，標(biāo)記有核膜（Lamin，RFP，粉色）、質(zhì)膜（CAAX，RFP，粉色）、肌動(dòng)蛋白（GFP，綠色）、微管蛋白（RFP，粉色）和細(xì)胞核（組蛋白，GFP，綠色）c) 解通道圖像（Lamin，深棕色；CAAX，橙色；肌動(dòng)蛋白，藍(lán)色；微管蛋白，品紅色；組蛋白，綠色） d) 基于形態(tài)特征提取的所有解多通道標(biāo)簽的 PAGA 初始化 UMAP 嵌入。e) PAGA 初始化 UMAP 嵌入顯示肌動(dòng)蛋白、微管蛋白和 CAAX 標(biāo)簽的軸長(zhǎng)變化，以及使用組蛋白和 Lamin 分割測(cè)量的細(xì)胞核體積變化。PAGA 圖顯示平均簇年齡（天數(shù)）的變化，節(jié)點(diǎn)大小表示一個(gè)簇內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量，邊寬反映兩個(gè)簇之間的連接強(qiáng)度。f) 在 matrigel 條件下，所有細(xì)胞（肌動(dòng)蛋白）按其對(duì)齊指數(shù)（與最近的類(lèi)器官表面法線的絕對(duì)余弦角）著色。比例范圍為 0-1，其中 1（紅色）對(duì)應(yīng)于與類(lèi)器官表面垂直對(duì)齊的細(xì)胞。g) PAGA 初始化的 UMAP 嵌入和 PAGA 圖顯示使用從基質(zhì)膠、無(wú)基質(zhì)和瓊脂糖條件下分割的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)類(lèi)型聚類(lèi)。圖基于提取的所有分割細(xì)胞（肌動(dòng)蛋白）的形態(tài)測(cè)量。h) PAGA 初始化的 UMAP 嵌入顯示細(xì)胞軸比隨時(shí)間變化，并疊加顯示使用 PAGA 圖的平均聚類(lèi)年齡。PAGA 圖根據(jù)聚類(lèi)的平均年齡從淺灰色到黑色進(jìn)行顏色編碼。i) 每個(gè)形態(tài)類(lèi)型聚類(lèi)的示例細(xì)胞（肌動(dòng)蛋白）。j) 顯示標(biāo)記有肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞的類(lèi)器官示例圖像，顯示按其形態(tài)類(lèi)型聚類(lèi)著色的細(xì)胞。k) 堆疊條形圖顯示在基質(zhì)膠、無(wú)基質(zhì)和瓊脂糖條件下各個(gè)肌動(dòng)蛋白形態(tài)類(lèi)型聚類(lèi)中細(xì)胞的比例。l) 圖像顯示在第 6 天基質(zhì)膠條件下的細(xì)胞（肌動(dòng)蛋白）根據(jù)細(xì)胞對(duì)齊指數(shù)著色，以及在第 9 天無(wú)基質(zhì)和瓊脂糖條件下的細(xì)胞。m) 小提琴圖顯示在第 4 天到第 12 天所有三種條件下所有分割細(xì)胞的細(xì)胞對(duì)齊（肌動(dòng)蛋白）值。n) 線圖顯示在三種條件下香農(nóng)指數(shù)的變化，基于隨時(shí)間變化的每個(gè)簇的細(xì)胞數(shù)量（基質(zhì)膠 (n=3)、無(wú)基質(zhì) (n=3) 和瓊脂糖 (n=3)）。

矩陣通過(guò)調(diào)節(jié) WNT 通路影響類(lèi)器官的
形態(tài)發(fā)生和模式形成

為了理解在不同基質(zhì)條件（基質(zhì)膠、瓊脂糖、無(wú)矩陣）下生長(zhǎng)的類(lèi)器官中發(fā)展出的分子細(xì)胞狀態(tài)，我們對(duì)第 13 天的類(lèi)器官進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，差異表達(dá)基因的基因本體分析顯示出多個(gè)信號(hào)通路的富集，包括WNT、Notch、FGF 和 Hippo 信號(hào)通路以及與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。

基質(zhì)膠誘導(dǎo)的神經(jīng)外胚層的強(qiáng)烈形態(tài)變化，以及在無(wú)基質(zhì)條件下 WNT 和 Hippo 信號(hào)通路的上調(diào)，測(cè)試了YAP調(diào)節(jié)對(duì)類(lèi)器官發(fā)育的影響。綜合證實(shí)了我們應(yīng)用含有外部基底膜豐富的 ECM 的 matrigel，導(dǎo)致腔體擴(kuò)張并自我模式化為主要的頭側(cè)前腦區(qū)域，并且 YAP1 的激活和 WLS 表達(dá)水平的增加促進(jìn)了發(fā)育中的神經(jīng)上皮的尾部化。

在對(duì)人類(lèi)早期腦類(lèi)器官的形態(tài)動(dòng)力學(xué)研究中，Viventis LS2 Live光片顯微鏡以極低的光毒性，通過(guò)多視角、多位置、長(zhǎng)時(shí)程的活細(xì)胞成像，展現(xiàn)腦類(lèi)器官的整個(gè)發(fā)育過(guò)程。在單次長(zhǎng)時(shí)程成像過(guò)程中，同時(shí)收集多個(gè)樣本在不同條件下的數(shù)據(jù)，結(jié)合自我開(kāi)發(fā)的分析流程、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析、信號(hào)通路探索分析，展示了YAP1 在基質(zhì)介導(dǎo)的形態(tài)發(fā)生和類(lèi)器官模式化中發(fā)揮的作用。

總的來(lái)說(shuō)，這一應(yīng)用案例為理解類(lèi)器官發(fā)育的形態(tài)動(dòng)力學(xué)提供了技術(shù)進(jìn)步，提供了對(duì)基質(zhì)介導(dǎo)的神經(jīng)上皮信號(hào)通路的機(jī)制性見(jiàn)解，并為未來(lái)探索人類(lèi)大腦發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞外微環(huán)境鋪平了道路。

參考文獻(xiàn)：
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3.Akanksha Jain et.al Morphodynamics of human early brain organoid development bioRxiv | August 21, 2023

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