PIpetty電動移液器在基孔肯雅病毒核酸檢測（實時熒光-PCR）中的應(yīng)用
  方 案 摘 要：

    本方案聚焦 Pipetty 電動移液器在基孔肯雅病毒核酸實時熒光 - PCR 檢測中的應(yīng)用。該移液器憑借高精度、自動化及防污染設(shè)計，在檢測各環(huán)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用。?在樣本前處理與 RNA 提取階段，微量分液功能提高 RNA 洗脫回收率；PCR 體系配制時，連續(xù)分液模式快速分配試劑，防污染吸頭避免氣溶膠污染；質(zhì)量控制中，精準(zhǔn)移取對照品保證結(jié)果可靠。同時，其具備溫度補償功能、能減少人為誤差，提升效率與準(zhǔn)確性，且維護(hù)成本低、合規(guī)性強，為檢測提供有力支持，保障結(jié)果的精準(zhǔn)與可重復(fù)。

 
  方 案 詳 情：

一、實驗原理  

    病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下產(chǎn)生cDNA，可作為聚合酶鏈(PCR)擴(kuò)增反應(yīng)的模版。TagMan探針實時熒光定量PCR時,在反應(yīng)體系中加入一對病毒特異性引物和一條熒光基團(tuán)標(biāo)記的病毒特異性探針。Tagllan探針的兩端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán),在探針完好的情況下,報告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號被淬滅基團(tuán)所吸收，因而檢測不到熒光信號。
    
    在PCR擴(kuò)增過程中，探針和引物與目標(biāo)序列結(jié)合，當(dāng)新生鏈沿著cDNA模板延伸到熒光標(biāo)記的探針結(jié)合位點時，Tag酶發(fā)揮5'一3’核酸外切酶的功能，熒光報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光基團(tuán)釋放熒光信號。這樣模板每擴(kuò)增一次，就產(chǎn)生一個游離的熒光分子，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板可進(jìn)行定量分析。其中RNA逆轉(zhuǎn)錄過程可以和PCR擴(kuò)增反應(yīng)同時進(jìn)行也可先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其他類似機(jī)制的熒光探針也可用于核酸檢測。



二、?實驗準(zhǔn)備

1、設(shè)配和材料

 ① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250及配套吸頭;
 ② 離心管(1.5 mL、0.2 mL 和 0.1 mL);
 ③ 試管架(5 mL、1.5 mL和 20μL );
 ④ 高速冷凍離心機(jī);
 ⑤ 旋渦混合器;
 ⑥ 熒光定量 PCR 儀等;

 
2，試劑和材料

  ① 病毒核酸提取試劑盒;
 ② 熒光定量 RT-PCR試劑盒;
 ③ 引物及探針等(參考序列下):
CHIKV-FP：5’-TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3'
CHIKV-RP：5’-CCGTGTTCGGGATCACTGTTA-3’
CHIKV-P：5’-FAMTGCCCACACTGTGA-BHQ1-3’(帶下劃線的堿基需要 LNA 修飾)。

三、實驗步驟

1、病毒 RNA 提取：待檢標(biāo)本用病毒 RNA 提取試劑盒提取，操作步驟按說明書進(jìn)行，制備的病毒核酸作為 Real-time RT-PCR的模板。
2、配置反應(yīng)體系

2×RT-PCR 混合液	10	含酶、dNTPs 等基礎(chǔ)反應(yīng)成分
上游引物（10μM）	0.8	特異性結(jié)合 CHIKV cDNA 正義鏈
下游引物（10μM）	0.8	特異性結(jié)合 CHIKV cDNA 反義鏈
熒光探針（10μM）	0.4	結(jié)合靶序列，擴(kuò)增時釋放熒光信號
模板 RNA	5	待檢測的病毒 RNA（可根據(jù)濃度調(diào)整）
無 RNA 酶水	3	補足體系至 20μL

 

1. 根據(jù)試驗要求設(shè)置陰性、陽性、內(nèi)參對照。
2. 根據(jù)需要檢測的樣品數(shù)量，配制反應(yīng)體系，將混合液、引物、探針、水充分混勻后分裝，使用Pipetty電動移液器的連續(xù)分液模式，設(shè)置每次分液量和連續(xù)分液次數(shù)，每管分液15μL，轉(zhuǎn)移反應(yīng)管至樣品制備區(qū)。

 
5、自動更換吸頭，設(shè)置分液量和分液次數(shù)，吸取RNA溶液，在反應(yīng)管中分別加入5μL RNA ，使每管總體積達(dá)到 20μL，記錄反應(yīng)管對應(yīng)的樣品編號。應(yīng)注意操作過程中，每次操作都更換新的滅菌吸頭，嚴(yán)防不同樣品間的交叉污染。反應(yīng)液分裝時避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。
6、Real-time RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增：一步法Real-time RT-PCR檢測反應(yīng)條件為: 42℃ 15 min，95℃ 2min，95℃ 10 s，62℃ 30 s，45 個循環(huán)，儀器設(shè)置在每一循環(huán) 62℃退火/延伸步驟讀取熒光信號。該反應(yīng)條件可根據(jù)采用的試劑要求進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

 
 
四、試驗結(jié)果

1、以熒光 PCR 反應(yīng)的前 3~15 個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，以本底信號標(biāo)準(zhǔn)差的 10 倍作為熒光閾值，標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號達(dá)到熒光閾值時所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值(Ct 值)。
2、檢測樣品的 Ct 值≤35.0，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，可報告樣品特異性核酸檢測陽性。檢測樣品的 Ct 值介于 35~45 之間時，屬臨界區(qū)間，建議重復(fù)檢測。若重復(fù)檢測結(jié)果 Ct 值≥45.0者為陰性；若 Ct值仍介于 35~45 之間，且擴(kuò)增曲線有明顯的指數(shù)增長特征者，可報告樣品特異性核酸檢測陽性。
3、陽性對照的 Ct 值應(yīng)≤32.0，并出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線；陰性對照 Ct 值應(yīng)≥45；否則視為實驗結(jié)果無效，需重復(fù)檢測。