近日，倫敦帝國理工學院抗菌藥物優化中心，倫敦衛生和熱帶醫學學院傳染病和熱帶病學院Alaa Riezk et al.研究團隊，利用英國Kirkstall 3D 活細胞自動灌流培養系統模擬生理流體流動，對比了靜態和動態培養條件下巨噬細胞的反應及抗利什曼原蟲納米藥物的療效，強調了流體流動動力學在體外研究中的重要性，為皮膚利什曼病治療策略的優化提供了參考。

 一. 研究背景：
利什曼病是由利什曼原蟲引起的寄生蟲病，包括內臟利什曼病和皮膚利什曼病等，現有治療手段存在局限且新藥研發不足。傳統靜態細胞培養系統無法模擬體內動態環境，而動態培養系統能更好地模擬細胞在體內的生理條件，有助于更準確地研究細胞行為和病原體相互作用。本研究旨在探究Kirkstall 3D 活細胞自動灌流培養系統 模擬的動態流體灌注，對巨噬細胞功能及基于殼聚糖的抗利什曼原蟲制劑療效的影響。



 二. 主要實驗儀器/關鍵實驗步驟描述：
 1. 實驗準備階段    
 1.1 選擇實驗系統：選用英國Kirkstall QV介質灌注系統，其六腔光學托盤可實現細胞在不同介質灌注速率下的培養，且能直接觀察感染細胞并持續監測感染情況。為模擬人體間質液條件，通過數學和計算模型確定插入塊高度，以確保細胞表面流速符合皮膚間質液流速范圍。實驗設置了靜態（0 m/s）、慢速（\(1.45×10^{-9}m/s\) ，細胞位于腔室底部）和快速（\(1.23×10^{-7}m/s\) ，細胞位于插入塊上）三種流動條件   
1.2細胞與寄生蟲培養：利什曼原蟲（L. major，MHOM/SA/85/JISH118）的無鞭毛體從感染小鼠皮膚損傷處分離并轉化為前鞭毛體，在添加10%熱滅活胎牛血清（HiFCS）的Schneider昆蟲培養基中于26°C培養，定期通過BALB/c小鼠傳代，實驗使用低代數（<3代）前鞭毛體。從6 - 8周齡雌性BALB/c小鼠獲取骨髓來源的巨噬細胞（BMMs） ，從8 - 10周齡雌性CD1小鼠獲取腹腔巨噬細胞（PEMs） 。THP - 1細胞在添加L - 谷氨酰胺和10% HiFCS的RPMI - 1640培養基中，于37°C、5% \(CO_2\) 培養箱培養，每周按1/10比例傳代，用20 ng/mL佛波酯12 - 肉豆蔻酸13 - 乙酸酯（PMA）處理24小時誘導分化為巨噬細胞。  
2. 感染巨噬細胞：將巨噬細胞（PEMs、BMMs、THP - 1細胞）以每孔\(4×10^5\) 個細胞的密度接種在24孔板的12mm圓形玻璃蓋玻片上，在RPMI - 1640培養基（含10% HiFCS）中于37°C、5% \(CO_2\) 孵育24小時。之后，加入不同濃度的L. major前鞭毛體（使寄生蟲與巨噬細胞比例在0.5:1至15:1之間），在34°C、5% \(CO_2\) 環境下繼續孵育24小時。隨后，將三分之二的玻璃蓋玻片轉移至QV900系統進行動態培養，其余作為靜態對照，在相同溫度和\(CO_2\) 濃度下繼續培養72小時。培養結束后，用甲醇固定細胞，并用吉姆薩染色 。 


3. 測量巨噬細胞功能  
3.1吞噬作用：利用2μm直徑的熒光紅色標記乳膠珠評估巨噬細胞的吞噬作用。巨噬細胞感染L. major前鞭毛體并在不同流動條件下孵育0.5 - 24小時后，用冰冷PBS洗滌去除未內化的珠子，再用0.5% Triton X - 100和0.2 M NaOH裂解細胞。通過熒光酶標儀（激發波長575nm，發射波長610nm）分析細胞裂解物，以確定吞噬的乳膠珠數量，并根據細胞蛋白含量（使用Micro BCA蛋白試劑盒測定）進行標準化。實驗設置了細胞松弛素D（1μg/ml）抑制吞噬作用的對照組 。    
 3.2巨胞飲作用：采用pHrodo Red葡聚糖（在酸性環境中發熒光）測量巨噬細胞的巨胞飲作用。巨噬細胞感染寄生蟲后在不同流動條件下培養，用Live Cell Imaging Solution洗滌三次，然后在含10% HiFCS和40μg/mL pHrodo Red葡聚糖的RPMI - 1640培養基中于34°C、5% \(CO_2\) 孵育0.5 - 24小時。孵育結束后再次洗滌細胞，用熒光酶標儀（激發波長560nm，發射波長585nm）檢測巨胞飲活性。實驗使用10μg/ml丙嗪（已知的巨胞飲抑制劑）孵育巨噬細胞2小時，以抑制巨胞飲作用，作為對照組 。
 4. 藥物和納米顆粒的制備與表征   
4.1藥物和納米顆粒制備：兩性霉素B（AmB，純度≥95%）用DMSO溶解配制成10mM儲存液，再稀釋于含10%HiFCS的RPMI - 1640培養基中備用。取1g高分子量殼聚糖（MW = 310 - 375kDa）溶解于100mL 1%溶液，室溫攪拌24小時至澄清，用2M氫調節pH至6.5。制備納米顆粒時，在攪拌條件下，向10mL殼聚糖溶液中逐滴加入10mL TPP水溶液（制備空白納米顆粒不加AmB，制備載藥納米顆粒則加入0.5mL AmB），攪拌5分鐘后超聲15分鐘以減小粒徑，再通過0.2μm注射器過濾器過濾去除聚集體和較大顆粒，然后用30kDa離心過濾器（SPIn - X UF concentrators）離心純化和濃縮，去除未包裹的AmB，最后加入5%蔗糖作為冷凍保護劑進行凍干，48小時后收集凍干的納米顆粒并儲存于4°C 。     
4.2藥物和納米顆粒表征：通過高效液相色譜（HPLC）分析AmB，計算包封率（EE）和藥物負載量。公式分別為：EE（%） = 100×（總AmB重量 - 游離AmB重量）/總AmB重量；藥物負載量（%） = 100×（總AmB重量 - 游離AmB重量）/（殼聚糖重量 + TPP重量） 。使用ZetaSizer測量納米顆粒的平均直徑、zeta電位和多分散指數，用Malvern ZetaSizer軟件v7.11進行數據分析。 

5. 評估介質流動對藥物和納米顆粒療效的影響：將PEMs接種在玻璃蓋玻片上，在靜態條件下感染前鞭毛體24小時。之后，將三分之二含有感染巨噬細胞的蓋玻片轉移至QV900系統，在34°C、5% \(CO_2\) 培養箱中以360μL/min的流速進行動態培養，分別設置細胞位于腔室底部（慢速流動，\(1.45×10^{-9}m/s\) ）和位于插入塊上（快速流動，\(1.23×10^{-7}m/s\) ）兩種情況，其余蓋玻片作為靜態對照。在靜態感染24小時后，用于藥物活性研究的培養基中添加不同濃度的藥物（殼聚糖溶液、空白殼聚糖 - TPP納米顆粒、載藥AmB的殼聚糖 - TPP納米顆粒、純AmB）。72小時后，取出所有蓋玻片，用甲醇固定、吉姆薩染色，在顯微鏡下計數感染巨噬細胞數量，評估藥物對寄生蟲感染的抑制效果，使用Prism軟件（GraphPad）進行非線性S型曲線擬合（可變斜率）分析數據 。 



三. 研究結果
- 巨噬細胞功能：感染L. major的巨噬細胞（PEMs、BMMs和THP - 1）的吞噬和巨胞飲作用比未感染細胞顯著增強，且PEMs和BMMs的這兩種功能高于THP - 1細胞。動態流動條件下，巨噬細胞的吞噬和巨胞飲作用顯著降低，且流速越快，降低越明顯。     
- 抗利什曼原蟲活性：所有制劑在靜態培養中的抗利什曼原蟲活性均高于動態培養。隨著流速增加，殼聚糖溶液、空白殼聚糖 - TPP納米顆粒、載藥AmB的殼聚糖 - TPP納米顆粒以及純AmB的抗利什曼原蟲活性均顯著下降 。流體流動動力學對評估巨噬細胞功能和抗利什曼原蟲活性至關重要。流體流動會降低巨噬細胞的吞噬和巨胞飲功能，減少藥物積累，進而降低抗利什曼原蟲藥物的療效。未來研究應進一步探索流體流動對巨噬細胞行為的影響，以完善疾病機制研究和治療策略的開發。 
參考文獻：Comparative assessment of macrophage responses and antileishmanial efficacy in dynamic vs. Static culture systems utilizing chitosan-based formulations,Published: March 11, 2025

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