原代細胞分離培養實驗步驟及注意事項盤點_abio生物試劑品牌網
原代細胞（Primary cells）是指直接從機體取出的組織或細胞獲得單個細胞并在體外進行培養的細胞。組織主要指組織器官、外周血及胚胎等。由于原代細胞生長緩慢，繁殖一定的代數停止生長（一般10代以內）。
一、各類組織的取材技術：
1、 皮膚和粘膜的取材
主要取自于手術過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術操作，但面積一般2~4平方厘米。
2、內臟和實體瘤的取材
內臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細胞豐富的區域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結締組織。
3、血液細胞的取材
血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結等)分離細胞，取材時應注意抗凝。
4、 骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材
嚴格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養液洗一次后即可培養，不宜低溫存放。
5、動物組織取材
I、鼠胚組織取材
首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后(注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進入體內，影響組織活力)，取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。
II、幼鼠胚腎(或肺)取材
幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。
6、雞(鴨)鳥類胚胎組織取材步驟
1）、取孵化至適當胚齡(9~12天)的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。
2）、將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干;
經碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼;
3）、用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚;
4）、用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。
二、原代細胞與細胞系的區別
三、原代細胞分離培養
取材--分離--培養--鑒定
首先將組織從機體中取出，經胰蛋白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養基中培養，使細胞繁殖到一定系數后進行細胞鑒定。
四、實驗步驟：
1.取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。
2.在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養皿中，去除小腦和間腦。
3.將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養皿中。
4.用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。
5.大腦皮質放于DMEM中(含慶大霉素和谷氨酰胺 )，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。
6.室溫1 000×g離心8min，去上清液。
7.沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。
8.沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。
9.沉淀加入2ml DMEM(含慶大霉素和谷氨酰胺)培養液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。
10.靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。
加入DMEM完全培養液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養皿中，置于37℃、5％CO2培養箱內靜置培養24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養基，隨后隔天換液。
一、各類組織的取材技術：
1、 皮膚和粘膜的取材
主要取自于手術過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術操作，但面積一般2~4平方厘米。
2、內臟和實體瘤的取材
內臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細胞豐富的區域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結締組織。
3、血液細胞的取材
血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結等)分離細胞，取材時應注意抗凝。
4、 骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材
嚴格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養液洗一次后即可培養，不宜低溫存放。
5、動物組織取材
I、鼠胚組織取材
首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后(注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進入體內，影響組織活力)，取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。
II、幼鼠胚腎(或肺)取材
幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。
6、雞(鴨)鳥類胚胎組織取材步驟
1）、取孵化至適當胚齡(9~12天)的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。
2）、將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干;
經碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼;
3）、用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚;
4）、用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。
二、原代細胞與細胞系的區別
三、原代細胞分離培養
取材--分離--培養--鑒定
首先將組織從機體中取出，經胰蛋白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養基中培養，使細胞繁殖到一定系數后進行細胞鑒定。
四、實驗步驟：
1.取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。
2.在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養皿中，去除小腦和間腦。
3.將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養皿中。
4.用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。
5.大腦皮質放于DMEM中(含慶大霉素和谷氨酰胺 )，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。
6.室溫1 000×g離心8min，去上清液。
7.沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。
8.沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。
9.沉淀加入2ml DMEM(含慶大霉素和谷氨酰胺)培養液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。
10.靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。
加入DMEM完全培養液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養皿中，置于37℃、5％CO2培養箱內靜置培養24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養基，隨后隔天換液。
