在神經(jīng)退行性疾病研究領(lǐng)域，NOTCH2NLC（N2C）基因內(nèi)的GGC異常重復(fù)擴(kuò)增已成為研究重點(diǎn)。這種異常擴(kuò)增與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，包括神經(jīng)元核內(nèi)包涵體病（NIID）、帕金森病（PD）、額顳葉癡呆（FTD）和特發(fā)性震顫（ET）。正常人的GGC重復(fù)擴(kuò)增往往不超過(guò)30次，重復(fù)次數(shù)超過(guò)60次具有致病性，而許多患者的重復(fù)次數(shù)超過(guò)130次。

值得注意的是，部分患者在N2C-GGC重復(fù)擴(kuò)增中表現(xiàn)出AGC插入（編碼絲氨酸）。一些PD患者攜帶中度的GGC擴(kuò)增（41-64次），但AGC插入頻率是NIID患者的三倍，這表明GGC擴(kuò)增中的AGC插入以及重復(fù)片段大小可能是導(dǎo)致帕金森病的原因。最近的研究表明，N2C-GGC重復(fù)序列產(chǎn)生的多聚甘氨酸（polyG）蛋白可能會(huì)促進(jìn)神經(jīng)毒性，但帶有AGC插入的中度GGC重復(fù)的功能影響仍知之甚少。

新加坡國(guó)立神經(jīng)科學(xué)研究所等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家近日利用細(xì)胞模型和小鼠模型，深入探究了帶有絲氨酸的中度重復(fù)在神經(jīng)退行性疾病中的潛在病理生理機(jī)制。他們首次發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)序列會(huì)促進(jìn)線粒體損傷和過(guò)度髓鞘化，這與早期帕金森病患者的臨床觀察結(jié)果相符。這項(xiàng)研究成果發(fā)表在《Molecular Neurodegeneration》期刊上。
 

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員構(gòu)建了帶有不同大小的N2C2 GGC重復(fù)擴(kuò)增的細(xì)胞模型，并委托賽業(yè)生物構(gòu)建了攜帶N2C2 GGC中度重復(fù)（帶或不帶絲氨酸插入）的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。他們通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元興奮性，利用RNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析探究基因表達(dá)變化，并借助透射電鏡來(lái)觀察小鼠皮層的髓鞘結(jié)構(gòu)。

技術(shù)路線

構(gòu)建細(xì)胞模型來(lái)分析帶有絲氨酸的中度重復(fù)對(duì)神經(jīng)變性和線粒體功能的影響
↓
構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型來(lái)探究帶有絲氨酸的中度重復(fù)的潛在病理影響
↓
對(duì)32G13S小鼠大腦皮層的轉(zhuǎn)錄組分析表明線粒體相關(guān)通路和髓鞘成分失調(diào)
↓
通過(guò)免疫染色和透射電鏡分析確認(rèn)帶有絲氨酸的中度重復(fù)誘導(dǎo)了過(guò)度髓鞘化

研究結(jié)果
帶有絲氨酸的中度重復(fù)在體外促進(jìn)蛋白質(zhì)聚集，并損害線粒體功能

研究人員推測(cè)，GGC重復(fù)大小和AGC插入的存在可能會(huì)調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性。為了探究重復(fù)序列對(duì)神經(jīng)變性的影響，他們委托賽業(yè)生物合成了一系列不同的N2C2片段并構(gòu)建了表達(dá)載體，包括N2C2-13G（野生型）、45G和32G13S（GGC中度重復(fù)，絲氨酸含量為28.8%，與PD患者的AGC插入比例相似）、89G和63G27S（致病性GGC重復(fù)擴(kuò)增，絲氨酸含量為30%）（圖1）。

他們發(fā)現(xiàn)，隨著重復(fù)序列長(zhǎng)度增加，可溶性N2C蛋白減少，不溶性N2C蛋白增加，這表明形成了不溶性N2C-polyG聚集。值得注意的是，與45G相比，32G13S表現(xiàn)出更多的細(xì)胞死亡，說(shuō)明絲氨酸插入會(huì)加劇中度重復(fù)擴(kuò)增的神經(jīng)毒性。他們還發(fā)現(xiàn)，5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）及其代謝產(chǎn)物原卟啉IX（PPIX）能有效減輕體外N2C-polyG蛋白的聚集。
 

圖1. 帶有絲氨酸插入的中度重復(fù)促進(jìn)蛋白質(zhì)聚集

研究人員進(jìn)一步推測(cè)，帶有絲氨酸插入的N2C中度重復(fù)可能會(huì)損害線粒體功能。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞耗氧率（OCR），他們發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)呼吸速率隨GGC重復(fù)序列的增加而降低，而絲氨酸插入進(jìn)一步破壞了基礎(chǔ)呼吸。此外，線粒體產(chǎn)生的ATP也隨重復(fù)序列的增加而減少，且絲氨酸插入進(jìn)一步加劇了這種不利影響。這些結(jié)果表明，帶有絲氨酸的N2C中度重復(fù)會(huì)對(duì)線粒體功能產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致能量供應(yīng)中斷，這種中斷與細(xì)胞死亡和神經(jīng)變性有關(guān)。

帶有絲氨酸的中度重復(fù)讓小鼠表現(xiàn)出類似早期帕金森病的特征

為了進(jìn)一步探究帶有AGC插入的N2C-polyG中度重復(fù)擴(kuò)增的病理影響，研究人員委托賽業(yè)生物構(gòu)建了一系列N2C-polyG轉(zhuǎn)基因小鼠品系，包括N2C-30G（低度重復(fù)）、-45G（中度重復(fù)）和-32G13S（中度重復(fù)，絲氨酸插入量為28.9%）。與N2C-30G和45G相比，32G13S小鼠顯示出更明顯的纖維狀蛋白聚集，帕金森病關(guān)鍵蛋白LRRK2升高，線粒體活性受損以及酪氨酸羥化酶（TH，多巴胺合成限速酶）水平下降，這些結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)觀察到的線粒體功能障礙一致，也與帕金森病的臨床特征相吻合。

此外，他們還觀察到32G13S小鼠出現(xiàn)類似早期帕金森病的特征，包括在中腦形成纖維狀的α-突觸核蛋白聚集，以及大腦皮層和紋狀體中TH陽(yáng)性神經(jīng)元的減少（圖2），表明多巴胺能神經(jīng)元的缺失主要發(fā)生在大腦皮層和紋狀體，而不是中腦。這些結(jié)果表明，帶有絲氨酸插入的N2C中度重復(fù)序列會(huì)加速蛋白質(zhì)聚集，誘導(dǎo)線粒體功能障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性，并讓小鼠表現(xiàn)出類似早期帕金森病的特征。

圖2. 帶有絲氨酸的中度重復(fù)表現(xiàn)出類似早期帕金森病的表型

通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗分析，研究人員發(fā)現(xiàn)32G13S會(huì)誘導(dǎo)小鼠大腦皮層中的神經(jīng)元過(guò)度興奮。行為測(cè)試表明，12月齡的32G13S小鼠出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)障礙，具體表現(xiàn)為在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中的行走時(shí)間更短，在圓筒實(shí)驗(yàn)中的站立次數(shù)更少。這些數(shù)據(jù)表明，帶有絲氨酸的中度重復(fù)會(huì)觸發(fā)32G13S小鼠大腦皮層中的神經(jīng)元過(guò)度興奮，并誘發(fā)小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙。

帶有絲氨酸的中度重復(fù)誘導(dǎo)小鼠的過(guò)度髓鞘化

接下來(lái)，研究人員希望闡明與發(fā)病機(jī)制相關(guān)的潛在通路。通過(guò)比較32G13S和45G小鼠皮層的基因表達(dá)差異，他們發(fā)現(xiàn)32G13S小鼠的鈣離子信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路出現(xiàn)失調(diào)，而這兩條通路與線粒體功能密切相關(guān)。同時(shí)，與髓鞘成分相關(guān)的基因（包括MBP和MOG）在32G13S小鼠中出現(xiàn)了下調(diào)。令人驚訝的是，32G13S小鼠皮層中的MBP和MPG蛋白水平明顯提高，他們推測(cè)這是一種代償機(jī)制，通過(guò)產(chǎn)生髓鞘來(lái)維持重要的神經(jīng)元功能和信號(hào)傳輸，以應(yīng)對(duì)線粒體損傷引起的大腦皮層神經(jīng)元缺失。

為了進(jìn)一步證實(shí)髓鞘蛋白成分的上調(diào)，研究人員對(duì)12月齡的N2C小鼠進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)32G13S小鼠皮層中MBP蛋白水平顯著增加。與30G和45G小鼠相比，32G13S小鼠在皮層區(qū)域表現(xiàn)出更多的髓鞘分支、更長(zhǎng)的髓鞘長(zhǎng)度、更多的髓鞘連接和更厚的髓鞘，表明32G13S小鼠皮層中存在過(guò)度髓鞘化。他們通過(guò)透射電鏡也觀察到這些現(xiàn)象。同時(shí)，32G13S小鼠顯示出線粒體分支較少，表明線粒體網(wǎng)絡(luò)受損。這些數(shù)據(jù)表明，帶有絲氨酸的中度重復(fù)可在小鼠中誘導(dǎo)與線粒體功能障礙有關(guān)的過(guò)度髓鞘化。

結(jié)論

圖3. 圖文摘要

這項(xiàng)研究首次提供了證據(jù)，表明帶有絲氨酸的N2C-polyG中度重復(fù)可在體外促進(jìn)神經(jīng)毒性，并在體內(nèi)誘導(dǎo)類似于早期帕金森病的病理生理變化（圖3）。此外，帶有絲氨酸的中度重復(fù)可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)線粒體功能障礙、神經(jīng)過(guò)度興奮、過(guò)度髓鞘化和運(yùn)動(dòng)障礙。這些發(fā)現(xiàn)有助于人們深入了解早期帕金森病患者的N2C-polyG中度重復(fù)的臨床意義。

原文檢索
Tu H, Yeo XY, Zhang ZW, et al. NOTCH2NLC GGC intermediate repeat with serine induces hypermyelination and early Parkinson's disease-like phenotypes in mice. Mol Neurodegener. 2024 Nov 28;19(1):91. https://doi.org/10.1186/s13024-024-00780-2