揭秘雙抗細胞株構建的理論與實踐_abio生物試劑品牌網
1. 雙特異性抗體的優勢與挑戰
隨著蛋白質工程技術的不斷進步，雙/多特異性結構類型也越發多樣：重鏈和輕鏈以不同數量和不同形式組合形成各式各樣的分子結構。一般來說，雙特異性抗體根據是否包含可結晶片段（Fc）進行分類，藥代動力學、半衰期、Fc受體介導功能（如適用）和生物學活性等也會因分子結構而有顯著差異。
我們還可將不同抗原結合位點（如scFv或Fab）與其他蛋白結構域融合產生雙特異性抗體，從而進一步功能化。如今，臨床試驗中大多數候選藥物都是BiTE、DART、二聚體“杵臼結構”("knob-in-hole")抗體。
圖一 不同類型的雙抗結構圖
由于雙抗或者多抗有著兩個或多個位點與靶細胞交互作用，可實現更多靶向結合，并通過重定向具有細胞毒性的免疫效應細胞來激活更多免疫反應，例如T細胞和自然殺傷（Natural Killer）細胞的雙重定向可以產生更顯著的靶向細胞毒性效應。另外，雙特異性抗體在多結合位點和不同通路的參與之下，還可以降低出現耐藥性的幾率。
然而，雙抗在生產工藝當中依然面臨諸多挑戰。
由于雙抗的結構種類繁多，輕重鏈組合數非常多，需要在質粒構建就給出適合的解決方案。默克的CHOZN? GS和UCOE? 組合成熟，應用的雙抗成功案例非常多，可以大大提高前期摸索試驗的效率（數據見后文）。
雙抗結構類型的復雜性意味著會對蛋白表達和制造工藝帶來諸多挑戰，包括表達量低、雜質高、產品質量不穩定和蛋白質聚集等。本文結合兩篇文章重點探討的就是如何借助新技術來解決雙抗分子細胞株開發中的難題。
2. 首先通過兩篇文獻來介紹如何通過鏈間平衡優化雙抗的產量以及純度
對于共輕鏈的雙抗可以采取單載體或者雙載體的系統進行表達，如圖二所示，采用HCF-LC-HC的順序進行質粒構建，獲得的minipool產量和純度，分別只有200-400mg/L，33%的異源二聚體比例。
圖二 雙抗的質粒結構和表現
經過將三條鏈的順序進行調整，對比各鏈間組合的雙抗表達量與異源二聚體的純度，如圖三可以看出，HCF-HC-LC-LC的表現最好，minipool的產量達到912mg/L，POI（Protein of Interest）純度達到93%。因此，在對雙抗分子進行細胞株開發的前，質粒載體的構建優化是十分必要的。
圖三 不同質粒配對的蛋白表達和純度
對于一些十分難表達的分子，微小RNA（miRNA）的應用可以提高外源基因的表達。對于提高雙抗的表達有很大的幫助。它的原理主要涉及其在基因調控中的作用：
1） 靶向抑制因子；
2） 調節轉錄因子；
3） 增強mRNA的穩定性；
4） 調節細胞信號通路，改善細胞生長特性；
5）調節翻譯因子。
根據研究，將CHO細胞進行細胞工程改造，過表達miRNA-557，可顯著提高抗體表達量。多個分子在CHO細胞中瞬轉的結果，如圖四顯示，miR-557都能提高抗體的表達40%以上。
圖四 瞬時轉染miRNA對抗體表達的影響
在獲得瞬轉的結果，文章繼續探討穩定轉染后單克隆的表現，如圖五顯示，top克隆在表達量方面顯著提高，同時，細胞生長與代謝方面也具備一定優勢。
圖五 穩定轉染miRNA對難表達分子和細胞生長的影響
3. CHOZN? +UCOE? 平臺表達雙抗分子
圖六 UCOE?質粒結構
如上圖所示，默克UCOE?質粒的元件介紹，可以同時表達雙表達框的質粒，UCOE?序列作為持家基因的保守序列，可以顯著降低插入位點的甲基化水平，從而提高插入到任意位點的外源基因的表達。
我們在設計雙抗BCMA/CD3的四條鏈的質粒時，將其定為雙質粒表達，分別是UCOE-LC1-HC1和UCOE-LC2-HC2，兩個質粒載體轉染比例為1：1。
質粒轉染后按照5000cell/well進行minipool鋪板8塊96孔板，并進行titer篩選，96孔板的表達如下圖所示：有效minipool有600個，top表達水平45mg/L左右。
圖七 96孔板階段minipool表達量
經過minipool的擴培，Top20 minipool的fedbatch結果如圖八所示，經過對minipool的產量與雙抗純度的研究，選取2個高表達與高純度的minipool進行單克隆的篩選，最終一共鋪板16塊，克隆形成率22%，通過單克隆成像，分析有效克隆將近500個。96孔板的數據如圖九所示。
圖八 Top20 minipool搖管Fedbatch的表達結果
圖九 單克隆在96孔板的表達結果
經過克隆的擴培，進行Top30進行Fedbatch，如圖八所示，top克隆表達量3g/L，并最終進行了異源二聚體的比例分析，采用去糖分子量的質譜方法，純度最高為85%。
圖十 Top30單克隆在搖管中的Fedbatch結果
注：紅色柱代表克隆來源于Minipool1，藍色柱來源于minipool2。Fedbatch培養基均為：EX-CELL? Advanced CHO Fed-batch培養基和Cellvento? ModiFeed Prime COMP。
以上是我們初步的雙抗測試結果，CHOZN? GS &UCOE? 平臺十分成熟，在低通量的篩選后，獲得較為突出的單克隆，在不經過任何工藝優化的前提下，獲得表達量3g/L，單體比例85%的雙抗單克隆。
4. 總結
綜上所述，雙抗的開發工藝十分復雜，可以更多的從分子設計，載體構建等方面進行鏈間表達平衡的優化。那么，將復雜問題簡單化，默克的CHOZN? GS + UCOE? 平臺可以作為優質的解決方案，提供完備的protocol與成熟的團隊支持。除此之外，CHOZN? GS & UCOE? 平臺在國內外市場，對于單抗、融合蛋白以及雙抗等各種分子都有豐富的實際案例，雙抗經過高通量篩選，工藝優化后最高的實際案例能達到10g/L以上。
Reference：
Zhang, S., et al. (2015). Biotechnology Progress 31(4): 1077-1085.
Simon Fischer et.al. miRNA Engineering of CHO Cells Facilitates Production of Difficult-to-Express Proteins and Increases Success in Cell Line Development
Barbara Tevelev. Et. Al. Genetic rearrangement during site specific integration event facilitates cell line development of a bispecific molecule
[1] Labrijn, Aran F. , Maarten L. Janmaat,Janice M. Reichert and Paul W. H. I. Paren. Bispecific antibodies: amechanistic review of the PIpeline. NatureReviews Drug Discovery. 18: 585–608 (2019).
[2] Global Bispecific Antibody Market to 2025:Drug Sales & Clinical Pipeline Insights with an $8 Billion MarketOpportunity. Research and Markets. 18 Jan. 2019. Web.
[3] Bispecific Antibodies Market - GlobalIndustry Insights, Trends, Outlook, and Opportunity Analysis, 2018-2026. Rep.Coherent Market Insights. Oct. 2019. Web.
[4] Bispecific Antibodies Market By Type(Immunoglobulin G (IgG) Like Molecule, Non Immunoglobulin G (IgG) LikeMolecule), by Application (Oncology, Autoimmune Disease, Others) - Growth,Future Prospects & Competitive Analysis, 2018 – 2026. Rep. CredenceResearch. Dec. 2018. Web.
隨著蛋白質工程技術的不斷進步，雙/多特異性結構類型也越發多樣：重鏈和輕鏈以不同數量和不同形式組合形成各式各樣的分子結構。一般來說，雙特異性抗體根據是否包含可結晶片段（Fc）進行分類，藥代動力學、半衰期、Fc受體介導功能（如適用）和生物學活性等也會因分子結構而有顯著差異。
我們還可將不同抗原結合位點（如scFv或Fab）與其他蛋白結構域融合產生雙特異性抗體，從而進一步功能化。如今，臨床試驗中大多數候選藥物都是BiTE、DART、二聚體“杵臼結構”("knob-in-hole")抗體。
圖一 不同類型的雙抗結構圖
由于雙抗或者多抗有著兩個或多個位點與靶細胞交互作用，可實現更多靶向結合，并通過重定向具有細胞毒性的免疫效應細胞來激活更多免疫反應，例如T細胞和自然殺傷（Natural Killer）細胞的雙重定向可以產生更顯著的靶向細胞毒性效應。另外，雙特異性抗體在多結合位點和不同通路的參與之下，還可以降低出現耐藥性的幾率。
然而，雙抗在生產工藝當中依然面臨諸多挑戰。
由于雙抗的結構種類繁多，輕重鏈組合數非常多，需要在質粒構建就給出適合的解決方案。默克的CHOZN? GS和UCOE? 組合成熟，應用的雙抗成功案例非常多，可以大大提高前期摸索試驗的效率（數據見后文）。
雙抗結構類型的復雜性意味著會對蛋白表達和制造工藝帶來諸多挑戰，包括表達量低、雜質高、產品質量不穩定和蛋白質聚集等。本文結合兩篇文章重點探討的就是如何借助新技術來解決雙抗分子細胞株開發中的難題。
2. 首先通過兩篇文獻來介紹如何通過鏈間平衡優化雙抗的產量以及純度
對于共輕鏈的雙抗可以采取單載體或者雙載體的系統進行表達，如圖二所示，采用HCF-LC-HC的順序進行質粒構建，獲得的minipool產量和純度，分別只有200-400mg/L，33%的異源二聚體比例。
圖二 雙抗的質粒結構和表現
經過將三條鏈的順序進行調整，對比各鏈間組合的雙抗表達量與異源二聚體的純度，如圖三可以看出，HCF-HC-LC-LC的表現最好，minipool的產量達到912mg/L，POI（Protein of Interest）純度達到93%。因此，在對雙抗分子進行細胞株開發的前，質粒載體的構建優化是十分必要的。
圖三 不同質粒配對的蛋白表達和純度
對于一些十分難表達的分子，微小RNA（miRNA）的應用可以提高外源基因的表達。對于提高雙抗的表達有很大的幫助。它的原理主要涉及其在基因調控中的作用：
1） 靶向抑制因子；
2） 調節轉錄因子；
3） 增強mRNA的穩定性；
4） 調節細胞信號通路，改善細胞生長特性；
5）調節翻譯因子。
根據研究，將CHO細胞進行細胞工程改造，過表達miRNA-557，可顯著提高抗體表達量。多個分子在CHO細胞中瞬轉的結果，如圖四顯示，miR-557都能提高抗體的表達40%以上。
圖四 瞬時轉染miRNA對抗體表達的影響
在獲得瞬轉的結果，文章繼續探討穩定轉染后單克隆的表現，如圖五顯示，top克隆在表達量方面顯著提高，同時，細胞生長與代謝方面也具備一定優勢。
圖五 穩定轉染miRNA對難表達分子和細胞生長的影響
3. CHOZN? +UCOE? 平臺表達雙抗分子
圖六 UCOE?質粒結構
如上圖所示，默克UCOE?質粒的元件介紹，可以同時表達雙表達框的質粒，UCOE?序列作為持家基因的保守序列，可以顯著降低插入位點的甲基化水平，從而提高插入到任意位點的外源基因的表達。
我們在設計雙抗BCMA/CD3的四條鏈的質粒時，將其定為雙質粒表達，分別是UCOE-LC1-HC1和UCOE-LC2-HC2，兩個質粒載體轉染比例為1：1。
質粒轉染后按照5000cell/well進行minipool鋪板8塊96孔板，并進行titer篩選，96孔板的表達如下圖所示：有效minipool有600個，top表達水平45mg/L左右。
圖七 96孔板階段minipool表達量
經過minipool的擴培，Top20 minipool的fedbatch結果如圖八所示，經過對minipool的產量與雙抗純度的研究，選取2個高表達與高純度的minipool進行單克隆的篩選，最終一共鋪板16塊，克隆形成率22%，通過單克隆成像，分析有效克隆將近500個。96孔板的數據如圖九所示。
圖八 Top20 minipool搖管Fedbatch的表達結果
圖九 單克隆在96孔板的表達結果
經過克隆的擴培，進行Top30進行Fedbatch，如圖八所示，top克隆表達量3g/L，并最終進行了異源二聚體的比例分析，采用去糖分子量的質譜方法，純度最高為85%。
圖十 Top30單克隆在搖管中的Fedbatch結果
注：紅色柱代表克隆來源于Minipool1，藍色柱來源于minipool2。Fedbatch培養基均為：EX-CELL? Advanced CHO Fed-batch培養基和Cellvento? ModiFeed Prime COMP。
以上是我們初步的雙抗測試結果，CHOZN? GS &UCOE? 平臺十分成熟，在低通量的篩選后，獲得較為突出的單克隆，在不經過任何工藝優化的前提下，獲得表達量3g/L，單體比例85%的雙抗單克隆。
4. 總結
綜上所述，雙抗的開發工藝十分復雜，可以更多的從分子設計，載體構建等方面進行鏈間表達平衡的優化。那么，將復雜問題簡單化，默克的CHOZN? GS + UCOE? 平臺可以作為優質的解決方案，提供完備的protocol與成熟的團隊支持。除此之外，CHOZN? GS & UCOE? 平臺在國內外市場，對于單抗、融合蛋白以及雙抗等各種分子都有豐富的實際案例，雙抗經過高通量篩選，工藝優化后最高的實際案例能達到10g/L以上。
Reference：
Zhang, S., et al. (2015). Biotechnology Progress 31(4): 1077-1085.
Simon Fischer et.al. miRNA Engineering of CHO Cells Facilitates Production of Difficult-to-Express Proteins and Increases Success in Cell Line Development
Barbara Tevelev. Et. Al. Genetic rearrangement during site specific integration event facilitates cell line development of a bispecific molecule
[1] Labrijn, Aran F. , Maarten L. Janmaat,Janice M. Reichert and Paul W. H. I. Paren. Bispecific antibodies: amechanistic review of the PIpeline. NatureReviews Drug Discovery. 18: 585–608 (2019).
[2] Global Bispecific Antibody Market to 2025:Drug Sales & Clinical Pipeline Insights with an $8 Billion MarketOpportunity. Research and Markets. 18 Jan. 2019. Web.
[3] Bispecific Antibodies Market - GlobalIndustry Insights, Trends, Outlook, and Opportunity Analysis, 2018-2026. Rep.Coherent Market Insights. Oct. 2019. Web.
[4] Bispecific Antibodies Market By Type(Immunoglobulin G (IgG) Like Molecule, Non Immunoglobulin G (IgG) LikeMolecule), by Application (Oncology, Autoimmune Disease, Others) - Growth,Future Prospects & Competitive Analysis, 2018 – 2026. Rep. CredenceResearch. Dec. 2018. Web.
