肥胖會引發一系列的疾病，如糖尿病、心腦血管疾病、非酒精性脂肪肝甚至腫瘤等。棕色脂肪組織（Brown adipose tissue，BAT）作為一個產熱器官能將化學能轉變為熱能，在維持機體體溫和能量穩態中發揮重要的作用，提高棕色脂肪的產熱能力對肥胖的治療具有非常重要的意義。棕色脂肪從胚胎期開始發育，但是關于棕色脂肪發育調控的研究并不清楚。本課題致力于找到調控棕色脂肪發育和功能的機制，為肥胖的治療提供可能的靶點。

2024年10月15日，廈門大學生科院在《Cell Death & Differentiation》（生物學1區Top， IF=13.7）發表題目為SOX4 facilitates brown fat development and mAIntenance through EBF2-mediated thermogenic gene program in mice的論文,初步闡明了SOX4對棕色脂肪發育的影響，揭示了SOX4通過EBF2調控棕色脂肪發育和功能的具體機制。廈門大學生科院和醫學院博士后王帥、何婷、博士羅芽是該文章的共同第一作者，李博安教授和郭慧玲副教授，廈門大學附屬第一醫院李衛華教授以及廈門大學醫學院李奇淵教授為該文章的通訊作者[1]。
 

BAT作為一種產熱器官，能夠將化學能轉化為熱能，對維持機體的體溫和能量平衡起著關鍵作用。因此，增強棕色脂肪的產熱能力對治療肥胖具有重要意義。盡管棕色脂肪自胚胎階段就開始發育，但其發育調控的具體機制仍不明確。本研究發現在BAT前體細胞（Sox4-MKO）或棕色脂肪細胞（Sox4-BKO）中敲除SOX4會導致BAT白化，并在急性冷暴露下出現低溫癥。Sox4-MKO小鼠的產熱能力降低，使其對飲食誘導的肥胖更易感。相反，在BAT中過表達SOX4可以增強產熱能力，對抗飲食誘導的肥胖。從機制上講，SOX4激活EBF2的轉錄，而EBF2決定了褐色脂肪的命運。此外，SOX4在S235位點的磷酸化通過PKA促進其核轉位進一步促進EBF2轉錄。進一步地，SOX4與EBF2結合，激活調控產熱基因表達的轉錄程序。

研究材料：
體內實驗：Pref1-Sox4小鼠由賽業（Cyagen）公司構建。小鼠在特定條件下被飼養在群體籠中：溫度保持在22–24 °C，相對濕度為50–60%，并設定12小時的明暗循環，光照從早上7:00開始。所有小鼠均為年齡匹配的雄性C57BL/6遺傳背景的小鼠。

在冷耐受測試（CTT）中，小鼠在測試前一周被單獨飼養在22 °C的籠子里。在實驗當天，小鼠禁食4小時，飲水后轉移至4 °C的單獨籠中。在規定時間內，使用直腸溫度計（NJKEWBIO, FT3400）測量直腸溫度。實驗結束后，所有小鼠被安樂死以進行后續實驗。

體外實驗：研究人員構建了BAT SVF永生化的細胞系，利用慢病毒進行敲低和過表達，在進行體外分化誘導實驗。

技術方法
通過RNA-seq，ChIP-qPCR, FAIRE assay，OCR、小鼠代謝籠，免疫共沉淀、QPCR、免疫熒光染色、染色質免疫共沉淀等實驗分析。

技術路線

研究結果
1 棕色脂肪的發育和功能維持需要SOX4的參與
為了探究SOX4的缺失對棕色脂肪的影響，研究人員分別取出生后一天（P1天）和成年后小鼠（8周齡）的棕色脂肪組織進行H＆E染色分析。如圖1 A所示，P1天的Sox4-MKO小鼠棕色脂肪的白化程度高于其對照組，H＆E染色結果進一步說明了Sox4-MKO小鼠棕色脂肪的脂滴相對于其對照組更大（圖1 B）。8周齡的Sox4-MKO小鼠棕色脂肪的白化程度依然高于其對照組，如圖1 C-D所示。由于棕色脂肪從胚胎期就開始發育，研究人員進一步檢測了兩組小鼠在胚胎期第15.5天（E15.5天）棕色脂肪的形態，如圖1 E所示，Sox4-MKO小鼠的棕色脂肪明顯比其對照組小，UCP1的表達量也明顯低于對照組。以上結果表明棕色脂肪的發育需要SOX4的參與。
 

小鼠棕色脂肪的發育需要SOX4的參與

（A-B）出生后一天（雄鼠）的Sox4^f/f和Sox4-MKO小鼠背部棕色脂肪的解剖圖（A），（B）為兩組小鼠棕色脂肪的H＆E染色圖，標尺為25 μm。（C-D）8周齡（雄鼠）的Sox4^f/f和Sox4-MKO小鼠背部棕色脂肪的解剖圖（C），（D）為兩組小鼠棕色脂肪的H＆E染色圖，標尺為75 μm。（E）E15.5天（雄鼠）的Sox4^f/f和Sox4-MKO小鼠背部棕色脂肪橫切面的H＆E染色圖和UCP1免疫熒光染色圖，標尺如圖所示。

為了進一步探究SOX4是否能抑制棕色脂肪的白化，研究人員進一步分析了在棕色脂肪祖細胞中過表達SOX4小鼠模型（Pref1-Sox4小鼠）的表型。首先研究人員先檢測了WT組小鼠和Pref1-Sox4組小鼠BAT SVF中SOX4的表達量，如圖2A所示，Pref1-Sox4組小鼠BAT SVF中SOX4的表達量明顯高于WT組小鼠，說明小鼠模型構建成功。研究人員進一步分析了8周齡小鼠棕色脂肪的表型，Pref1-Sox4組小鼠棕色脂肪的棕化程度高于其對照組（2 B），H＆E染色結果表明Pref1-Sox4組小鼠棕色脂肪的脂滴更小（2 C）。以上結果表明SOX4能抑制棕色脂肪的白化。

過表達SOX4抑制了棕色脂肪白化

（A）WT組小鼠和Pref1-Sox4組小鼠（8周，雄鼠）BAT SVF中SOX4的表達量。（B-C）8周齡雄性的WT鼠和Pref1-Sox4鼠棕色脂肪組織的解剖圖（B），圖C為兩組小鼠棕色脂肪對應的H＆E染色圖，標尺為60 μm。

綜上所述研究人員得出以下結論：①SOX4是小鼠棕色脂肪發育過程中必不可少的元件。②SOX4可能參與小鼠棕色脂肪生理狀態的維持。

2 SOX4的過表達促進了小鼠的產熱能力
為探究SOX4對棕色脂肪產熱功能的影響，研究人員比較了WT組與Pref1-Sox4組小鼠的體溫和代謝指標。如圖3A-B，出生后1天的Pref1-Sox4組小鼠表面溫度（32 ℃）顯著高于WT組（28.2 ℃）。在8周齡時，常溫下兩組小鼠體溫無明顯差異；但急劇冷刺激下，Pref1-Sox4組在第4小時體溫降至最低，隨后回升至37 ℃，而WT組降至35.5 ℃(圖3C)。冷刺激后，Pref1-Sox4組血糖較低，且其棕色脂肪的TG含量在常溫及冷刺激條件下均低于WT組 (圖3D-E)。此外，在冷刺激下，Pref1-Sox4組的產熱顯著高于對照組(圖3F)。這些結果表明，SOX4的過表達增強了棕色脂肪的產熱功能及冷刺激下的代謝水平。

SOX4促進棕色脂肪的產熱能力

（A）出生后一天的WT和Pref1-Sox4小鼠（雄鼠）的熱成像圖（A），其熱成像的量化圖為（B），n=3。（C）取8周齡的雄性小鼠，單籠飼養一周再饑餓4 h后，一組放在常溫，檢測其6小時以內的體溫變化，n=7-8；一組直接轉移到4 ℃冷房，在冷刺激的第0 h，第1 h，第2 h，第3 h，第4 h，第5 h，第6 h檢測其直腸溫度，n=4-6。（D）體溫采集實驗結束后，尾靜脈取血檢測其血糖水平，n=5。（E）將小鼠安樂死后，取棕色脂肪組織檢測TG含量，n=5。（F）將9周齡雄性小鼠的生存溫度從22 °C降低至4 °C，檢測其熱量產生，n=6。

3 SOX4促進棕色脂肪細胞的分化
為了進一步確認SOX4的過表達能否促進棕色脂肪細胞的分化，研究人員又從WT小鼠和Pref1-Sox4過表達小鼠的棕色脂肪組織中分離了BAT SVF細胞進行體外誘導實驗（圖4 A）。如圖4 B所示，過表達組細胞的脂滴囤積明顯少于對照組細胞，TG含量檢測實驗進一步表明SOX4的過表達能明顯降低細胞內TG的含量（圖4 C）。研究人員還進一步探究了SOX4的過表達對產熱基因的影響，如圖4 D所示，SOX4的過表達明顯促進了Ucp1、Pgc1α、Prdm16、Pparα和Dio2等產熱基因的表達，但是SOX4的過表達并不會影響白色選擇性基因Retn和Agt的表達水平，僅僅會使Lyz2的表達水平輕微下調。如圖4 E所示，SOX4的過表達能促進PGC1-α、UCP1和PRDM16等蛋白的表達。最后研究人員還提取了兩組細胞的DNA，檢測了Nd1、Nd2和Nd4的表達水平。如圖4 F所示，SOX4的過表達并沒有改變Nd1、Nd2和Nd4的表達水平，說明SOX4的過表達并沒有促進線粒體合成。
 

SOX4促進棕色脂肪細胞的分化

（A-C）從WT小鼠和Pref1-Sox4過表達小鼠（雄鼠，3周齡）的棕色脂肪組織中分離BAT SVF細胞直接進行體外誘導實驗，實驗設計方案如圖A所示。在誘導后的第7天，進行油紅染色實驗（B）和TG含量測定實驗（C），標尺長度為100 μm。(D) 在誘導后的第7天，RT-PCR檢測Ucp1、Pgc1α、Prdm16和Dio2等產熱基因的mRNA水平以及白色選擇性基因的mRNA水平。（E）兩組細胞產熱相關蛋白的表達水平。（F）提取兩組細胞的DNA，RT-PCR檢測線粒體數量相關基因（Nd1、Nd2和Nd4）的表達。

4 在棕色脂肪細胞分化過程中SOX4激活EBF2的表達
為了進一步探究SOX4調控棕色脂肪早期發育的機制，研究人員利用敲低Sox4的BAT SVF細胞以及其對照細胞進行時間點收樣實驗。如圖5A-B所示，SOX4的缺失完全抑制了Ebf2的表達。進一步的回補實驗表明，Ebf2的過表達能有效抑制TG的累積，有效抑制了產熱基因的下調（圖5C-D)。進一步的實驗表明，SOX4可以與EBF2形成復合體，兩者共同促進Ebf的轉錄激活。以上結果表明，SOX4一方面可以作為Sox4的下游，促進產熱基因的表達，另一方面，兩者還能互相結合形成轉錄復合體，共同促進Ebf2的轉錄。
 

SOX4與EBF2協同促進Ebf2的表達

在加入誘導劑后的第0天、第2天、第4天和第6天分別收細胞，通過RT-PCR檢測調控棕色脂肪發育早期，中期和晚期轉錄因子的mRNA水平。（B）對對照組細胞和敲低組細胞進行棕色化誘導，分別在誘導的第0 h，第1 h，第2 h，第8 h，第12 h進行定點收樣，用RT-PCR檢測特定的基因。（C-D）在BAT SVF細胞中，先用慢病毒將Sox4敲低，再慢病毒過表達Ebf2，構建穩轉細胞系后進行棕色化誘導。在誘導后的第7天，分別檢測細胞的TG水平和產熱基因的mRNA水平。（E-G）內源IP、外援IP和免疫熒光證明SOX4與EBF2相互結合。（H）在NIH3T3細胞中，分別過表達SOX4, EBF2，或同時過表達SOX4和EBF2,分別檢測對EBF2的轉錄激活情況。

總結
在本研究中，研究人員發現SOX4對BAT的發育和產熱程序是必需的。在BAT前體細胞（Sox4-MKO）或褐色脂肪細胞（Sox4-BKO）中缺乏SOX4會導致褐色脂肪白化，并在急性冷暴露下出現低溫癥。Sox4-MKO小鼠的產熱能力降低，使其對飲食誘導的肥胖更易感。相反，在BAT中過表達SOX4可以增強產熱能力，對抗飲食誘導的肥胖。從機制上講，SOX4激活EBF2的轉錄，而EBF2決定了褐色脂肪的命運。此外，SOX4在S235位點的磷酸化通過PKA促進其核轉位和EBF2轉錄。進一步地，SOX4與EBF2結合，激活調控產熱基因表達的轉錄程序。這些結果表明SOX4作為EBF2的上游調節因子，為BAT的發育和產熱功能的維持提供了寶貴的見解（圖6）。在進一步實驗中仍需解決一些問題。研究人員的實驗數據表明，SOX4對于棕色脂肪細胞的分化是必需的。為了進一步分析SOX4在確定棕色脂肪細胞命運中的作用，未來需要確認譜系追蹤研究。此外，SOX4的磷酸化如何介導其核轉位并促進其轉錄活性仍不清楚。

本文的研究模式圖

參考文獻
Wang S, He T, Lu Y, et al. SOX4 facilitates brown fat development and maintenance through EBF2-mediated thermogenic gene program in mice [J]. Cell Death Differ 2024: https://doi.org/10.1038/s41418-024-01397-0.