方案摘要：本方案登革病毒中和試驗中應(yīng)用了 PIpetty 電動移液器，以實現(xiàn)對血清中登革病毒中和抗體的精準檢測。試驗基于登革病毒與特異性中和抗體結(jié)合后會失去感染能力的原理，采用組織培養(yǎng)中和試驗法。通過 Pipetty 電動移液器的混勻、連續(xù)分液等功能，完成病毒 TCID50 測定、血清系列稀釋、抗體與病毒混合孵育、接種細胞培養(yǎng)等步驟，借助觀察細胞病變效應(yīng)（CPE），按 Reed-Muench 法判定中和抗體滴度，并通過對照驗證確保試驗有效性。該方案利用 Pipetty 電動移液器的精準操作，提高了試驗的準確性與效率，為登革病毒感染的診斷及相關(guān)研究提供可靠支持。
 
方案詳情：
一、實驗原理
       當人體感染登革病毒后，血清中可產(chǎn)生保護性的中和抗體，登革病毒與這種特異性抗體作用后，能被特異性地“中和”，抑制登革病毒的復(fù)制與繁殖，使其失去感染能力。中和試驗包括動物中和試驗、組織培養(yǎng)中和試驗和空斑減少中和試驗三種，每種中和試驗又分為固定病毒稀釋血清法和固定血清稀釋病毒法兩種。動物中和試驗由于需要特殊的感染動物房，一般的實驗室很難做到，所以更多的實驗室采用的是組織培養(yǎng)中和試驗和空斑減少中和試驗，其中空斑減少中和試驗比組織培養(yǎng)中和試驗更敏感、特異，但由于前者對操作技術(shù)的要求更高，而且病毒噬斑小，出斑時間長，對細胞覆蓋培養(yǎng)基的要求也高，故一般實驗室多用的是組織培養(yǎng)中和試驗。
二、? 實驗準備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 無菌細胞吹打管、吸管；
③ 無菌平底微量 96 孔組織培養(yǎng)板；
④ 無菌 1.5mL 塑料離心管；
⑤ 冰盒；
⑥ C0 ₂培養(yǎng)箱；
⑦ 生物安全柜；
⑧ 倒置顯微鏡。
 
2、試劑和材料
① 登革病毒 1~4型標準毒株、C6/36 細胞、陽性和陰性對照血清;
② Vero 細胞
③ 細胞培養(yǎng)液：如含 10% 胎牛血清的 DMEM 或 RPMI-1640；
④ 維持液：含 2% 胎牛血清的培養(yǎng)液；
⑤ 對照樣本：陰性血清、陽性血清。
 
 
 
三、實驗步驟
1、病毒 TCID ₅₀測定（提前 1-2 天完成）
a) 使用Pipetty電動移液器的混勻模式，將標準病毒株用維持液做 10 倍系列稀釋（10 ^-1 至 10 ^-8）；
 
b) 設(shè)置連續(xù)分液模式，在96孔板中每孔加入 100μL 稀釋后的病毒液，每個稀釋度設(shè) 4 復(fù)孔；
c) 加入預(yù)先鋪好的 Vero 單層細胞（每孔約 1×10?個細胞），37℃、5% CO?培養(yǎng)；
d) 每日觀察 CPE（細胞變圓、脫落、聚集等），持續(xù) 5-7 天；
e) 按 Reed-Muench 法計算 TCID ₅₀，確定 100 TCID ₅₀對應(yīng)的病毒稀釋倍數(shù)。
2、用維持液對待檢血清、陽性對照血清、陰性對照血清做 2 倍系列稀釋（如 1:10、1:20、1:40…… 至 1:1280），每稀釋度設(shè) 3-4 復(fù)孔。
3、使用Pipetty電動移液器，按1:1的方式，取適量血清和含 100 TCID ₅₀的病毒液添加至離心管，充分混勻后，設(shè)置連續(xù)分液模式，在孔板中每孔加入 200μL 的混合液；
4、設(shè)置對照孔：
a）病毒對照：100μL 維持液 + 100μL 100 TCID ₅₀病毒液；
b）細胞對照：100μL 維持液 + 100μL 維持液（無病毒和血清）；
c）37℃孵育 1 小時（讓抗體與病毒充分結(jié)合）。
5、接種細胞并培養(yǎng)
a）棄去 96 孔板中預(yù)先鋪好的 Vero 細胞的原有培養(yǎng)液；
b）設(shè)置連續(xù)分液模式，在孔板中每孔加入上述中和反應(yīng)后的混合液 100μL，37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
 
c）培養(yǎng) 2-3 天后，若培養(yǎng)液變黃，可半量更換維持液（避免細胞營養(yǎng)不足）。
6、每日用倒置顯微鏡觀察 CPE，記錄各孔是否出現(xiàn) CPE（以 “+” 表示有 CPE，“-” 表示無 CPE），觀察至病毒對照孔出現(xiàn) 75% 以上 CPE（通常 5-7 天），且細胞對照孔無 CPE 時終止觀察。
四、結(jié)果判定
1、中和抗體滴度定義：能抑制 50% 復(fù)孔出現(xiàn) CPE 的血清最高稀釋度的倒數(shù)。
2、計算方法：按 Reed-Muench 法，統(tǒng)計各稀釋度血清中 “無 CPE 孔” 的比例，找到抑制 50% CPE 對應(yīng)的稀釋度。
3、對照驗證：
a）病毒對照孔必須出現(xiàn)明顯 CPE；
b）細胞對照孔必須無 CPE；
c）陽性對照血清滴度需在預(yù)期范圍，陰性對照血清應(yīng)無中和作用（即所有復(fù)孔均出現(xiàn) CPE）。