Pipetty電動移液器在豬藍耳病PRRSV病毒檢測（分離與鑒定）中的應用_abio生物試劑品牌網(wǎng)
方案摘要：繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and ResPIratory syndrome，PRRS），是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory syndrome virus，PRRSV）感染豬引起的一種高度傳染性疫病，臨床表現(xiàn)為母豬繁殖系統(tǒng)障礙，斷奶仔豬消瘦、生長遲緩以及死亡率增加。該病能引起豬只體溫升高、呼吸困難，導致豬耳朵發(fā)紺，又稱藍耳病，本方案覆蓋 PRRSV 病毒分離（含病料預處理、敏感細胞接種、無病變時盲傳純化）與后續(xù)鑒定環(huán)節(jié)：分離階段，通過移液器精準移取病料上清、抑菌抗生素及細胞培養(yǎng)液，嚴格把控接種體積與盲傳移液量；鑒定階段，借助移液器定量分配抗體、洗滌液、底物液等，保障試劑用量一致性。核心通過精準移液消除體積誤差、更換吸頭防控交叉污染，為實驗重復性與結(jié)果準確性提供關鍵支撐。
方案詳情：
一、實驗原理
豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）分離與鑒定法，核心是 “先增殖再確認”。
分離原理：PRRSV 需寄生細胞，取病料（肺、血清等）處理后，接種 Marc-145 或豬肺泡巨噬細胞，37℃培養(yǎng) 3-7 天，病毒會利用細胞復制致細胞病變（CPE），未顯 CPE 則盲傳純化。
鑒定原理：用特異性方法驗證，如 IFA/IPMA 靠熒光 / 酶標 PRRSV 抗體結(jié)合抗原顯信號，RT-PCR 將病毒 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后，用特異引物擴增（或測序）確認，排除其他病毒干擾。
二、? 實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 二氧化碳培養(yǎng)箱（37 ℃）。
③ 冰箱（4 ℃、-20 ℃、-70 ℃）。
④ 倒置生物顯微鏡。
⑤ 恒溫水浴箱（37 ℃）。
⑥ 離心機及離心管（規(guī)格 10 mL）。
⑦ 96 孔微量細胞培養(yǎng)板。
⑧ 組織研磨器。
⑨ 微孔濾器（濾膜孔徑 0.22 um）。
2、試劑和材料
① 細胞生長液與維持液，。
② PRRSV 陽性血清或單克隆抗體。
③ 豬原代肺泡巨細胞（PAMs）或 MARC-145 細胞。
三、實驗步驟
1、用 RPMI1640 細胞生長液稀釋復蘇的 PAMs，細胞終濃度為每毫升 1X10 6個/ml， 細胞，或用DMEM 細胞生長液稀釋 MARC-145 細胞，細胞終濃度為每毫升5X10 4個細胞。然后，使用Pipetty電動移液器，設置連續(xù)分液模式，將稀釋的細胞加入 96 孔細胞培養(yǎng)板中100 μL/孔，置于 37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)長成單層。
2、更換新吸頭，在空白的 96 孔細胞培養(yǎng)板中加入細胞培養(yǎng)液 RPMI1640，90L/孔，在A排和E排各孔內(nèi)分別加入制備好的樣本，10 μL/孔（樣本 1∶10 稀釋，重復2孔），搖動培養(yǎng)板后，從 A排和E排孔各取10 μL，分別移入B排和F排孔內(nèi)（樣本1:100 稀釋）。搖動培養(yǎng)板后，再從B排和F排孔各取 10 μL分別移入 C排和 G排孔內(nèi)（樣本1:1 000 稀釋）。同樣，再從從C排和G排孔各取 10 L，分別移入D排和 H 排孔內(nèi)（樣本1:10 000 稀釋）。每個培養(yǎng)板應設置不接種樣本的細胞空白對照。一般而言，對用于 PRRSV 分離的樣本進行1:10和1:100稀釋即可。
3、吸取稀釋的樣本 50 μL，接種于對應的細胞孔（第1代）中，吸附1h后，加入細胞維持液，100 μL/孔，置于 37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞病變，連續(xù)觀察2d~5 d。
4、樣本初次接種細胞培養(yǎng)2d后，不論有無 CPE，應將每孔內(nèi)細胞液取 25 μL，移入按照 制備的新細胞板對應的孔內(nèi)（第2代），置于 37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2d~5 d，每天觀察 CPE。樣本的細胞培養(yǎng)物應盲傳 2代~3代。
5、用 PRRSV陽性血清或單克隆抗體，采用免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）或間接免疫熒光試驗（IFA），對出現(xiàn)細胞病變的培養(yǎng)物進行 PRRSV 的鑒定。
四、結(jié)果判定
1、PRRSV 感染細胞的 CPE 主要表現(xiàn)為細胞圓縮、聚集、固縮，最后崩解脫落。初次接種樣本和盲傳后均出現(xiàn) CPE，或盲傳后出現(xiàn) CPE，并經(jīng) IPMA 或 IFA 檢測為陽性，判定為 PRRSV 分離陽性。
2、初次接種樣本和盲傳后均無 CPE或出現(xiàn) CPE 但經(jīng) IPMA 或 IFA 檢測為陰性，判為 PRRSV 分離陰性。
方案詳情：
一、實驗原理
豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）分離與鑒定法，核心是 “先增殖再確認”。
分離原理：PRRSV 需寄生細胞，取病料（肺、血清等）處理后，接種 Marc-145 或豬肺泡巨噬細胞，37℃培養(yǎng) 3-7 天，病毒會利用細胞復制致細胞病變（CPE），未顯 CPE 則盲傳純化。
鑒定原理：用特異性方法驗證，如 IFA/IPMA 靠熒光 / 酶標 PRRSV 抗體結(jié)合抗原顯信號，RT-PCR 將病毒 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后，用特異引物擴增（或測序）確認，排除其他病毒干擾。
二、? 實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 二氧化碳培養(yǎng)箱（37 ℃）。
③ 冰箱（4 ℃、-20 ℃、-70 ℃）。
④ 倒置生物顯微鏡。
⑤ 恒溫水浴箱（37 ℃）。
⑥ 離心機及離心管（規(guī)格 10 mL）。
⑦ 96 孔微量細胞培養(yǎng)板。
⑧ 組織研磨器。
⑨ 微孔濾器（濾膜孔徑 0.22 um）。
2、試劑和材料
① 細胞生長液與維持液，。
② PRRSV 陽性血清或單克隆抗體。
③ 豬原代肺泡巨細胞（PAMs）或 MARC-145 細胞。
三、實驗步驟
1、用 RPMI1640 細胞生長液稀釋復蘇的 PAMs，細胞終濃度為每毫升 1X10 6個/ml， 細胞，或用DMEM 細胞生長液稀釋 MARC-145 細胞，細胞終濃度為每毫升5X10 4個細胞。然后，使用Pipetty電動移液器，設置連續(xù)分液模式，將稀釋的細胞加入 96 孔細胞培養(yǎng)板中100 μL/孔，置于 37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)長成單層。
2、更換新吸頭，在空白的 96 孔細胞培養(yǎng)板中加入細胞培養(yǎng)液 RPMI1640，90L/孔，在A排和E排各孔內(nèi)分別加入制備好的樣本，10 μL/孔（樣本 1∶10 稀釋，重復2孔），搖動培養(yǎng)板后，從 A排和E排孔各取10 μL，分別移入B排和F排孔內(nèi)（樣本1:100 稀釋）。搖動培養(yǎng)板后，再從B排和F排孔各取 10 μL分別移入 C排和 G排孔內(nèi)（樣本1:1 000 稀釋）。同樣，再從從C排和G排孔各取 10 L，分別移入D排和 H 排孔內(nèi)（樣本1:10 000 稀釋）。每個培養(yǎng)板應設置不接種樣本的細胞空白對照。一般而言，對用于 PRRSV 分離的樣本進行1:10和1:100稀釋即可。
3、吸取稀釋的樣本 50 μL，接種于對應的細胞孔（第1代）中，吸附1h后，加入細胞維持液，100 μL/孔，置于 37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞病變，連續(xù)觀察2d~5 d。
4、樣本初次接種細胞培養(yǎng)2d后，不論有無 CPE，應將每孔內(nèi)細胞液取 25 μL，移入按照 制備的新細胞板對應的孔內(nèi)（第2代），置于 37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2d~5 d，每天觀察 CPE。樣本的細胞培養(yǎng)物應盲傳 2代~3代。
5、用 PRRSV陽性血清或單克隆抗體，采用免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）或間接免疫熒光試驗（IFA），對出現(xiàn)細胞病變的培養(yǎng)物進行 PRRSV 的鑒定。
四、結(jié)果判定
1、PRRSV 感染細胞的 CPE 主要表現(xiàn)為細胞圓縮、聚集、固縮，最后崩解脫落。初次接種樣本和盲傳后均出現(xiàn) CPE，或盲傳后出現(xiàn) CPE，并經(jīng) IPMA 或 IFA 檢測為陽性，判定為 PRRSV 分離陽性。
2、初次接種樣本和盲傳后均無 CPE或出現(xiàn) CPE 但經(jīng) IPMA 或 IFA 檢測為陰性，判為 PRRSV 分離陰性。
