近日，南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院田博聞博士等為第一作者，廣州市婦女兒童醫(yī)療中心Chaoting Lan、夏慧敏教授、鐘微教授為共同通訊作者在《Inflammation》期刊發(fā)表了題為《EPIgenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers》的科研成果，研究通過多組學(xué)分析鑒定出壞死性小腸結(jié)腸炎（Necrotizing Enterocolitis, NEC）腸道組織中的新型甲基化調(diào)控生物標(biāo)志物。研究首先分析了NEC患者回腸和結(jié)腸組織的DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，鑒定出多個甲基化相關(guān)差異基因（Methylation-Related Differentially Expressed Genes, MrDEGs），并通過單細胞數(shù)據(jù)和靶基因甲基化測序（Targeted Bisulfite Sequencing, TBS）技術(shù)驗證這些基因在NEC中的潛在診斷價值。
 
  標(biāo)題：Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers（壞死性小腸結(jié)腸炎的表觀遺傳學(xué)見解：揭示甲基化調(diào)控的生物標(biāo)志物） 發(fā)表時間：2025年2月
發(fā)表期刊：Inflammation
影響因子：IF5/Q2
技術(shù)平臺：靶基因甲基化測序（TBS）

壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）是一種多因素引起的胃腸道疾病，在早產(chǎn)兒中具有較高的發(fā)病率和死亡率。本研究旨在通過多組學(xué)分析，鑒定出NEC腸道組織中的新型甲基化調(diào)控生物標(biāo)志物。研究首先分析了NEC患者回腸和結(jié)腸組織的DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，揭示了啟動子區(qū)域的甲基化水平與轉(zhuǎn)錄水平呈負相關(guān)，進而鑒定出甲基化相關(guān)差異基因（MrDEGs），這些基因包括ADAP1、GUCA2A、BCL2L14、FUT3、MISP、USH1C、ITGA3、UNC93A和IL22RA1。單細胞數(shù)據(jù)顯示，這些MrDEGs主要位于腸道組織的腸道上皮區(qū)域。通過靶基因甲基化測序（TBS）和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）驗證這些MrDEGs，研究人員成功鑒定并驗證了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP基因主要在腸道上皮絨毛細胞中表達。通過基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）揭示這些基因主要參與NEC中T細胞分化和抑制腸道炎癥的病理過程。本研究加深了對NEC發(fā)病機制的理解，并可能推動NEC預(yù)測和診斷新的精準(zhǔn)醫(yī)療方法發(fā)展。

研究方法
樣本收集：共收集16份腸道組織樣本，包括8份NEC患者的回腸組織樣本和8份對照組樣本。
數(shù)據(jù)來源：從GEO數(shù)據(jù)庫中收集NEC的基因表達和DNA甲基化數(shù)據(jù)集，包括GSE212913（回腸）、GSE212997（結(jié)腸）和GSE46619（結(jié)腸和回腸）。單細胞數(shù)據(jù)來自Adi Egozi團隊研究。
DNA甲基化數(shù)據(jù)分析：差異甲基化區(qū)域（DMRs）分析，并通過UCSC數(shù)據(jù)庫進行基因組注釋。
轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析：篩選差異表達基因（DEGs），并進行基因集富集分析（GSEA）。
單細胞數(shù)據(jù)分析：單細胞數(shù)據(jù)分析，過濾低質(zhì)量細胞-基因，并進行UMAP降維分群。
免疫浸潤分析：分析免疫細胞浸潤情況。
靶基因甲基化測序（TBS）：對NEC患者和對照組回腸組織樣本進行TBS驗證，檢測靶基因甲基化水平。
RT-qPCR：驗證靶基因的RNA表達水平。
免疫熒光染色分析：檢測NEC和對照組腸道組織中IL22RA1基因的表達差異。
  圖1：本研究分析流程
結(jié)果圖形
（1）結(jié)腸和回腸NEC病變中的DNA甲基化特征
研究發(fā)現(xiàn)，NEC患者的結(jié)腸和回腸組織中普遍存在高甲基化現(xiàn)象。在回腸中，共有357個區(qū)域的甲基化水平發(fā)生變化，其中262個區(qū)域甲基化水平增加，95個區(qū)域甲基化水平降低。結(jié)腸中甲基化水平變化的區(qū)域有1550個，其中994個區(qū)域甲基化水平增加，556個區(qū)域甲基化水平降低。甲基化區(qū)域主要位于啟動子區(qū)域，結(jié)腸中啟動子區(qū)域甲基化比例為45%（702/1550），回腸中為34.35%（123/357）。這些結(jié)果表明，NEC組織的高甲基化可能通過沉默下游基因表達介導(dǎo)疾病發(fā)生發(fā)展。
  圖2：GSE212997和GSE212913數(shù)據(jù)集中的人NEC中差異甲基化區(qū)域及GSE46619 數(shù)據(jù)集中人NEC 中差異表達基因。

a-b. 人NEC組和對照組（CTRL）樣本中DMRs散點圖。橫軸表示NEC和CTRL的平均甲基化水平，縱軸表示兩組甲基化水平差異。紅色點代表顯著上調(diào)的區(qū)域，藍色點表示顯著下調(diào)的區(qū)域。
c-d. 不同區(qū)域（啟動子、外顯子、內(nèi)含子、基因間區(qū)、3’UTR 和遠端基因間區(qū)）DMRs 比例扇形圖。
e.  與NEC標(biāo)志基因相關(guān)DEGs火山圖。
f.   DEGs 的GSEA分析。
g.  免疫浸潤分析預(yù)測免疫細胞比例箱線圖?？v軸表示免疫細胞的富集水平，橫軸表示每種免疫細胞名稱。
 
（2）NEC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的免疫學(xué)特征
通過對GSE46619轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分析，揭示了NEC樣本中共有1,693個差異表達基因（DEGs），其中499個上調(diào)基因和1,194個下調(diào)基因。這些基因包括已知的NEC標(biāo)志基因，如TLR4、CXCL8、PLA2G7、HBEGF和FABP2。通過GSEA分析揭示了與NEC相關(guān)的基因集主要參與免疫炎癥通路，如NF-κB信號通路、IL-17信號通路和TNF信號通路。免疫浸潤分析顯示，NEC組中激活的樹突狀細胞、效應(yīng)記憶CD4⁺ T細胞、未成熟樹突狀細胞（immature dendritic cells）、巨噬細胞（macrophages）、肥大細胞（mast cells）、髓源性抑制細胞(MDSCs)、NKT細胞(Natural killer T cell)、中性粒細胞（neutrophils,）、漿細胞樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells）、調(diào)節(jié)性T細胞、T濾泡輔助細胞、Th1細胞和Th17細胞數(shù)量與對照組存在顯著差異（圖2g）。這些結(jié)果表明，免疫細胞過度激活在NEC的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
 
（3）NEC中MrDEG的多組學(xué)聯(lián)合分析
研究通過結(jié)合DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果篩選出9個甲基化調(diào)控基因，包括ADAP1、GUCA2A、BCL2L14、FUT3、MISP、USH1C、ITGA3、IL22RA1和UNC93A。這些基因在NEC組織中DNA甲基化水平升高和RNA表達水平降低。單細胞數(shù)據(jù)分析顯示，這些基因主要在腸道上皮細胞中表達，尤其是腸絨毛細胞。通過靶基因甲基化測序（TBS）和RT-qPCR驗證，驗證了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP這4個基因的甲基化水平與RNA表達水平呈負相關(guān)，表明其可能是NEC的潛在生物標(biāo)志物。
  圖3：篩選甲基化相關(guān)差異基因（MrDEGs）并分析其在NEC單細胞數(shù)據(jù)集中的定位。
  a.   不同腸道部位甲基化相關(guān)基因上調(diào)或下調(diào)基因UpSet圖。
b-c. ADAP1/GUCA2A的甲基化區(qū)域比對到到基因組上的UCSC基因組瀏覽器圖。黑色區(qū)域表示高甲基化位置，條形圖顯示NEC組與對照組的平均甲基化水平。
d.   按細胞類型分類的單細胞圖譜。
e.   按疾病分類的單細胞圖。
f.   點圖顯示按細胞類型分類的MrDEGs。
g.   由MrDEGs著色的UMAP圖。
 
（4）驗證MrDEG DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組水平
研究通過TBS技術(shù)對NEC患者和對照組的回腸組織樣本進行甲基化水平檢測，檢測結(jié)果揭示ADAP1、GUCA2A、IL22RA1、MISP、UNC93A和USH1C基因在NEC組織中的甲基化水平顯著升高。RT-qPCR結(jié)果表明，這些基因在NEC組織中的RNA表達水平顯著降低。這些結(jié)果進一步驗證這些基因在NEC中的甲基化調(diào)控作用。
  圖4：在人組織樣本中驗證甲基化相關(guān)差異基因（MrDEGs）的甲基化水平和RNA表達。

1. MrDEGs甲基化水平可視化。熱圖顯示CpG島的甲基化水平，右側(cè)指示該CpG島測序的起始位置。
2. 顯示MrDEGs甲基化水平差異直方圖。
3. NEC患者中甲基化相關(guān)基因的mRNA表達水平。

 
（5）MrDEG 功能預(yù)測
通過單細胞數(shù)據(jù)分析結(jié)果揭示了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP主要在腸道上皮細胞的腸絨毛細胞中表達。HE染色結(jié)果顯示，NEC組織的腸絨毛結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損。通過GSEA分析揭示這些基因的低表達與TNF信號通路、NF-κB信號通路、IL-17信號通路和Toll樣受體信號通路的過度激活有關(guān)。這些通路過度激活可能導(dǎo)致腸道細胞炎癥反應(yīng)加劇，從而加重NEC病理過程。
  圖5：通過單細胞數(shù)據(jù)和單基因GSEA分析預(yù)測MrDEGs定位和作用。

1. 按細胞類型分類的腸上皮細胞簇的重新聚類圖譜。
2. 按疾病分類的腸上皮細胞簇的重新聚類圖譜。
3. 由MrDEGs著色的UMAP圖。
4. H&E染色實驗分析NEC組和對照組腸絨毛結(jié)構(gòu)的病理變化，

e-h. MrDEGs組中的免疫相關(guān)基因集。
 
討論和啟示
本研究通過多組學(xué)分析，揭示了NEC中DNA甲基化的調(diào)控機制，并鑒定出多個潛在的甲基化調(diào)控生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物在NEC的早期診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療中具有重要的應(yīng)用前景。此外，研究還探討了這些生物標(biāo)志物在NEC病理過程中的作用機制，為未來開發(fā)新的治療策略提供了理論基礎(chǔ)。未來的研究需要在更大的臨床樣本中驗證這些發(fā)現(xiàn)，并進一步探索這些生物標(biāo)志物在NEC發(fā)病機制中的具體作用。
  圖6：甲基化相關(guān)差異基因（MrDEGs）篩選過程及其作用機制示意圖。  
靶基因甲基化測序分析（TBS）在本研究中發(fā)揮了重要作用。TBS技術(shù)通過檢測靶基因甲基化水平，為研究NEC中的DNA甲基化調(diào)控機制提供了直接證據(jù)。TBS技術(shù)的單堿基分辨率和高靈敏度使其能夠準(zhǔn)確檢測到NEC組織中基因啟動子區(qū)域的甲基化變化，從而揭示了這些基因在NEC中的潛在調(diào)控作用。未來類似標(biāo)志物篩選驗證研究中，TBS技術(shù)可以作為一種重要的工具，用于驗證和篩選潛在的甲基化調(diào)控生物標(biāo)志物，為疾病的早期診斷和治療提供新思路。

參考文獻：
Tian B, Xu X, Li L, Tian Y, Liu Y, Mu Y, Lu J, Song K, Lv J, He Q, Zhong W, Xia H, Lan C. Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers. Inflammation. 2024 May 30. doi: 10.1007/s10753-024-02054-x.