在遺傳譜系追蹤實驗的設(shè)計過程中，基因的異位表達往往需要我們著重關(guān)注的問題。目的啟動子在非目的組織中的表達被稱為異位表達。為了更精準的標(biāo)記特定細胞類型，避免異位表達的影響，我們可以借助兩個（甚至以上）的標(biāo)記物進行標(biāo)記，這時標(biāo)記細胞就需要使用到多重組酶介導(dǎo)的遺傳方法。
 
圖. 異位表達對譜系示蹤的影響^[1]

上一期，我們講述了雙重組酶介導(dǎo)的獨家報告基因類型，這種類型常用于標(biāo)記 A⁺B^-（反之亦然）的細胞類型，這種標(biāo)記存在先后順序，相反的先后順序會極大的影響后續(xù)的標(biāo)記結(jié)果。而本次課程，我們來講述另一種常用的標(biāo)記A⁺B^-的報告基因系統(tǒng)——嵌套報告基因系統(tǒng)。

譜系示蹤系類課程往期回顧：
【譜系示蹤系列第一期】基礎(chǔ)細胞標(biāo)記方式
【譜系示蹤系列第二期】單重組酶介導(dǎo)的多色報告系統(tǒng)方法
【譜系示蹤系列第三期】多重組酶介導(dǎo)的交叉報告基因方法
譜系示蹤的難點——基因標(biāo)記的異位表達如何避免？（上） 

嵌套報告基因系統(tǒng)

嵌套報告基因系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是 Rosa26-CAG-site2-site1-Stop-site1-reporter A-site2-reporter B。這類系統(tǒng)是利用兩個重組系統(tǒng)，將一對識別位點放置于另一對識別位點與報告基因的兩端，形成一個重組系統(tǒng)包裹著另一個重組系統(tǒng)的嵌套結(jié)構(gòu)。如果內(nèi)部的重組系統(tǒng)發(fā)生重組后，外部的重組系統(tǒng)仍然可以發(fā)生第二次重組；但外部重組系統(tǒng)發(fā)生重組時，內(nèi)部的序列全部被切除，無法進行再次重組。

以下圖為例，嵌套報告基因小鼠的基因重組為：

圖. 嵌套報告基因小鼠的基因重組圖解^[1]

1 A⁺B^- 細胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達，Cre 酶會切除兩個 loxP 位點之間的序列（第一個 stop 序列被切除）。該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達綠色熒光 ZsGreen。

2 A⁺B⁺ 細胞：
makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、一對 Loxp 位點與全部的 stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達紅色熒光 tdTomato。

3 A^-B⁺ 細胞：
makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（綠色熒光 ZsGreen、一對 Loxp 位點與全部的 stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達紅色熒光 tdTomato。

因此，A⁺B^-細胞被標(biāo)記為綠色。A^-B⁺細胞、A⁺B⁺細胞被標(biāo)記為紅色。

嵌套報告基因小鼠如何幫助我們避免基因標(biāo)記的異位表達呢？若我們想標(biāo)記 MarkerA 的細胞，啟動子 A 介導(dǎo)的 Cre-loxP 內(nèi)部重組可能導(dǎo)致細胞 A 呈綠色。然而，如果啟動子 A 在“不需要的”細胞 B（A⁺B⁺細胞）中也被激活，由于 B 類型細胞中特定啟動子 B 驅(qū)動的外部 Dre-rox 重組已經(jīng)去除 ZsGreen 基因，因此這部分“不需要的”細胞 B（A⁺B⁺細胞）仍呈現(xiàn)紅色。通過使用嵌套報告基因系統(tǒng)將異位表達的細胞標(biāo)記為其他顏色，從而排除 MarkerA 異位表達的影響。

案例1

Sox9+ 膽道上皮細胞是否在肝臟再生過程中形成肝細胞仍然存在爭議。一些譜系追蹤研究報告說，Sox9-CreER 標(biāo)記的膽道上皮細胞（BEC）可能有助于體內(nèi)平衡和損傷后的肝細胞；其他研究報告說，新產(chǎn)生的肝細胞來源于損傷后預(yù)先存在的肝細胞。值得注意的是，Sox9 在 BEC 和一些門脈周圍肝細胞中表達，這導(dǎo)致使用傳統(tǒng)的 Sox9-CreER 標(biāo)記不夠準確，新的肝細胞可能來自Sox9-CreER 標(biāo)記的預(yù)先存在的肝細胞。
 

圖. 使用傳統(tǒng)的方法標(biāo)記 Sox9⁺ 細胞無法準確標(biāo)記 BECs^[2]

因此利用肝細胞特異性標(biāo)記白蛋白 Alb-DreER與嵌套報告基因系統(tǒng)可區(qū)分Sox9+ BEC和Sox9+ 肝細胞。Sox9+ BEC被標(biāo)記為綠色，Sox9+ Alb+肝細胞被標(biāo)記為紅色，Alb+肝細胞也被標(biāo)記為紅色。至此，精確標(biāo)記的ZsGreen+ BEC和tdTomato+ 肝細胞可用于重新評估 Sox9+ BEC 在肝臟修復(fù)過程中對肝細胞的貢獻。針對肝損傷后的小鼠進行熒光檢測分析表明，BEC 不會再生新的肝細胞，而只是在CCl₄ 誘導(dǎo)的肝損傷后增殖以補充 BEC。
 

圖. 嵌套報告基因系統(tǒng)準確標(biāo)記 BECs^[1]

因此，嵌套報告系統(tǒng)可用于破解一些定義具有已知陽性和陰性 marker 的干細胞的細胞命運。這種方式較獨家報告基因系統(tǒng)的優(yōu)勢是 Dre-rox 和 Cre-loxP 的重組順序不會影響最終結(jié)果，并且，嵌套報告基因系統(tǒng)更適合使用雙誘導(dǎo)型重組系統(tǒng)（例如 CreER 和 DreER）進行細胞譜系示蹤。

那么，經(jīng)過兩期的學(xué)習(xí)，處理基因異位表達的兩套報告基因系統(tǒng)大家了解了嗎？，我們來再次復(fù)習(xí)一下：

嵌套報告基因系統(tǒng)
Nested reporter systems

• 嵌套報告基因系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是 Rosa26-CAG-site2-site1-Stop-site1-reporter A-site2-reporter B。
• 嵌套報告系統(tǒng)可用于破解一些定義具有已知陽性和陰性marker的干細胞的細胞命運。
• Dre-rox 和 Cre-loxP 的重組順序不會影響最終結(jié)果
• 更適合使用雙誘導(dǎo)型重組系統(tǒng)

獨家報告基因系統(tǒng)
Exclusive reporter systems

• 獨家報告基因系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)是 Rosa26-CAG-site1-site2-Stop-site1-reporter A-Stop-site2-reporter B。
• 獨家報告系統(tǒng)可用于破解一些定義具有已知陽性和陰性marker的干細胞的細胞命運。
• 這種標(biāo)記存在先后順序，相反的先后順序會極大的影響后續(xù)的標(biāo)記結(jié)果。
• 建議兩個重組酶中一種采用可誘導(dǎo)類型的重組酶，從而合理控制重組發(fā)生的先后順序。

那在實際設(shè)計實驗時，我們應(yīng)該如何選擇報告系統(tǒng)呢？
 

嵌套報告基因系統(tǒng)VS獨家報告基因系統(tǒng)

選擇哪種雙報告系統(tǒng)取決是否需要控制A&B的表達重組酶的時間，以及重組酶的類型選擇。

情況一
A&B不僅在目的組織中特異性表達，也在發(fā)育期/干細胞期廣泛表達。
在這種情況下，由于AB表達位置存在發(fā)育期表達的干擾，因而需控制A、B蛋白的表達時間，此時存在兩種情況：

a. 僅需控制單個marker的表達時間：
以marker A 需控制表達為例，由于marker A需調(diào)控表達時間，因而需使用A介導(dǎo)的可誘導(dǎo)的重組酶。此時，B介導(dǎo)的重組酶可以選擇可誘導(dǎo)的或者是組成型的（無需誘導(dǎo)）。如果選擇組成型的話，請確保A和B發(fā)生的重組順序正確，即可選擇獨家報告系統(tǒng)；如果選擇可誘導(dǎo)的，這時我們需選擇嵌套報告系統(tǒng)。

b. 需控制雙個marker的表達時間：
這種情況下，A與B都需要選擇可誘導(dǎo)的重組酶，這時我們需選擇嵌套報告系統(tǒng)。

情況二
A&B僅在目的組織中特異性表達，不會在發(fā)育期/干細胞期表達。
在這種情況下，無需調(diào)控A&B的表達時間，選擇哪種雙報告系統(tǒng)就取決于重組工具的類型，如果B介導(dǎo)的重組工具是組成型的，而A介導(dǎo)的重組工具是誘導(dǎo)型的，即可選擇獨家報告系統(tǒng)；如果A和B介導(dǎo)的重組都是可誘導(dǎo)的，即可選擇嵌套報告系統(tǒng)。

多重組酶介導(dǎo)的遺傳方法增強了細胞命運圖譜的特異性和精確性，從而可以在生物過程中發(fā)現(xiàn)前所未有的細胞事件。策略的選擇主要取決于基因表達、可用的小鼠工具和要解決的科學(xué)問題。在避免基因異位表達方面，我們不僅可以在報告小鼠方面做文章，我們還可以針對重組酶進行設(shè)計。

下一期鼠博士為大家講解可用于避免基因異位表達的loxCre與roxCre報告系統(tǒng)。這一報告系統(tǒng)的神奇之處在于一種重組酶的活性受到另一種重組酶的調(diào)控，這種制約關(guān)系可幫助我們更精準地標(biāo)記目的細胞。請大家敬請期待~

Reference：
[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, CAI D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. doi: 10.1038/nm.4437. Epub 2017 Nov 13. PMID: 29131159; PMCID: PMC6913096.

[2] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapPIng studies. J Biol Chem. 2020 May 8;295(19):6413-6424. doi: 10.1074/jbc.REV120.011631. Epub 2020 Mar 25. PMID: 32213599; PMCID: PMC7212637.

上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領(lǐng)域，打造了以基因修飾動物模型研發(fā)為核心，涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評價等多個技術(shù)平臺，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動物模型產(chǎn)品解決方案。