近日，華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院和生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室葉邦策教授和尤迪副教授為共同通訊作者、符瑜博士為第一作者在微生物學(xué)領(lǐng)域著名期刊《mBio》上發(fā)表題為《A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria》的科研成果。研究通過ChIP-seq等分析揭示乙酰磷酸（Acetyl Phosphate, AcP）依賴的乙?；揎椌W(wǎng)絡(luò)在放線菌（Actinobacteria）中調(diào)控環(huán)二腺苷酸單磷酸（cyclic di-adenosine monophosphate，c-di-AMP）穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制。研究以紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea，S. erythraea）為模型，揭示AcP通過乙?；揎椨绊憙煞N關(guān)鍵蛋白：二腺苷酸環(huán)化酶（Diadenylate Cyclase, DisA）和其轉(zhuǎn)錄抑制因子DasR，從而調(diào)控c-di-AMP合成與降解，維持細(xì)胞內(nèi)c-di-AMP穩(wěn)態(tài)。其調(diào)控機(jī)制在放線菌中高度保守，并可能對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和抗生素合成產(chǎn)生重要影響。
 

標(biāo)題：A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria（乙酰磷酸依賴的修飾網(wǎng)絡(luò)調(diào)控放線菌中c-di-AMP穩(wěn)態(tài)） 發(fā)表時(shí)間：2024-07-09
發(fā)表期刊：mBio
影響因子：IF6.4/Q1
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq等
 
本研究提出一個(gè)由乙酰磷酸（AcP）調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)通過DisA和DasR這兩個(gè)不同的底物來負(fù)責(zé)c-di-AMP穩(wěn)態(tài)。研究揭示了AcP誘導(dǎo)的乙酰化通過破壞蛋白質(zhì)多聚體化來調(diào)控，從而通過DisA的K66位點(diǎn)乙?；种芻-di-AMP合成；而DasR的K78位點(diǎn)乙?；瘎t消除對(duì)disA的轉(zhuǎn)錄抑制。研究驗(yàn)證了AcP通過介導(dǎo)平衡c-di-AMP穩(wěn)態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵生理作用。進(jìn)一步的研究表明，乙酰化的DisA和DasR發(fā)生了構(gòu)象變化，這些變化在分化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。鑒于AcP誘導(dǎo)的乙酰化在響應(yīng)環(huán)境脅迫時(shí)的廣泛分布以及所鑒定關(guān)鍵位點(diǎn)的高度保守性，研究人員提出c-di-AMP穩(wěn)態(tài)調(diào)控可能是放線菌中心回路的一個(gè)基本特性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生理的整體調(diào)控。  
易小結(jié)
c-di-AMP是一種在細(xì)菌中廣泛存在的核苷酸第二信使，參與調(diào)控細(xì)胞壁完整性、滲透壓平衡、生物膜形成等多種生物學(xué)過程。易基因參與的前期研究揭示了c-di-AMP與紅色糖多孢菌（放線菌模式菌株）中GlcNAc信號(hào)之間的直接聯(lián)系，并闡明蛋白質(zhì)酰基化與c-di-GMP協(xié)同調(diào)控放線菌發(fā)育與抗生素合成機(jī)制的研究進(jìn)展。
詳見：
項(xiàng)目文章 | Nature子刊：ChIP-seq等揭示c-di-AMP與DasR互作以調(diào)控細(xì)菌生長(zhǎng)、發(fā)育和抗生素合成
項(xiàng)目文章 | NAR：ChIP-seq等揭示蛋白質(zhì)?；cc-di-GMP協(xié)同調(diào)控放線菌發(fā)育與抗生素合成機(jī)制
本研究再次突破，通過ChIP-seq等分析揭示了AcP依賴的乙酰化修飾網(wǎng)絡(luò)對(duì)c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機(jī)制，為理解放線菌的生長(zhǎng)發(fā)育、抗生素合成以及環(huán)境適應(yīng)機(jī)制提供了新視角，為開發(fā)新型抗菌藥物和優(yōu)化抗生素生產(chǎn)菌株奠定理論基礎(chǔ)。
 
研究要點(diǎn)
c-di-AMP鑒定對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)和細(xì)胞生理是必需的，因此本研究的主要挑戰(zhàn)是細(xì)胞信號(hào)和刺激如何進(jìn)入決定c-di-AMP濃度的決策過程，以及這些信息如何整合到調(diào)控通路中。研究以S. erythraea為模型驗(yàn)證了AcP依賴的DisA乙酰化及其轉(zhuǎn)錄抑制因子DasR參與協(xié)調(diào)環(huán)境信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，這對(duì)于c-di-AMP穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

具體而言，DisA的K66位點(diǎn)乙酰化直接失活其二腺苷酸環(huán)化酶活性，從而抑制c-di-AMP產(chǎn)生，而DasR的K78位點(diǎn)乙酰化則導(dǎo)致disA表達(dá)增加和c-di-AMP水平升高。因此，AcP是c-di-AMP維持中的一個(gè)關(guān)鍵分子開關(guān)，它響應(yīng)環(huán)境變化，可能抑制有效發(fā)育。因此，AcP介導(dǎo)的翻譯后修飾（PTM）構(gòu)成了合成酶/水解酶調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)。
 
乙酰磷酸（AcP）調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)通路示意圖
研究方法
蛋白質(zhì)乙酰化狀態(tài)檢測(cè)：通過免疫沉淀（ImmunopreciPItation, IP）和免疫印跡（Immunoblotting, IB）分析檢測(cè)DisA和DasR的乙?；?。
體外乙?；瘜?shí)驗(yàn)：利用AcP對(duì)DisA和DasR進(jìn)行體外乙酰化反應(yīng)，驗(yàn)證其乙?；稽c(diǎn)。
質(zhì)譜分析（LC-MS/MS）：鑒定乙?；揎椀奈稽c(diǎn)，確定DisA的K66和DasR的K78為關(guān)鍵乙?；稽c(diǎn)。
酶活性檢測(cè)：通過酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乙酰化對(duì)DisA二腺苷酸環(huán)化酶（DAC）活性的影響。
基因轉(zhuǎn)錄分析：利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR（Real-time RT-PCR）檢測(cè)disA基因的轉(zhuǎn)錄水平。
染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, ChIP-seq）：分析DasR在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，驗(yàn)證其對(duì)disA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
生物物理實(shí)驗(yàn)：圓二色光譜（Circular Dichroism, CD）分析、化學(xué)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)和生物層干涉（Biolayer Interferometry, BLI）實(shí)驗(yàn)，研究乙?；瘜?duì)蛋白結(jié)構(gòu)和DNA結(jié)合能力的影響。
細(xì)胞生理實(shí)驗(yàn)：通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察不同突變株的發(fā)育表型。
 
結(jié)果圖形
（1）AcP依賴的乙酰化直接抑制DisA的DAC活性
研究發(fā)現(xiàn)，在氮限制條件下，DisA乙?；斤@著升高，且AcP能夠直接乙?；疍isA。體外實(shí)驗(yàn)表明，乙?；疍isA的DAC活性降低約75%，表明AcP依賴的乙?；@著抑制了DisA的酶活性。進(jìn)一步的質(zhì)譜分析鑒定出DisA的K66為關(guān)鍵乙?；稽c(diǎn)，位于其DAC結(jié)構(gòu)域內(nèi)，該位點(diǎn)乙?；瘜?dǎo)致DisA八聚體結(jié)構(gòu)解離，從而抑制其DAC活性，減少c-di-AMP合成。
 
圖1：AcP誘導(dǎo)的DisA乙酰化抑制其DAC活性。
  (A) 在氮充足（N⁺）或氮限制（N^-）條件下，S. erythraea野生型（WT）菌株的DisA乙?；健?br> (B) 在37°C下，使用10 mM AcP對(duì)His標(biāo)簽的DisA蛋白進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)（0、1、3和5h）的乙?；幚怼Ｍㄟ^Western blotting使用特異性抗乙酰賴氨酸（anti-AcK）抗體檢測(cè)乙?；?。
(C) DisA野生型（DisA^WT）和乙?；疍isA（DisA^AcP）蛋白的DAC活性。
(D) DisA^WT和DisA^AcP蛋白的圓二色光譜（CD）圖。
(E) DisA的結(jié)構(gòu)域組織以不同顏色的方框表示。
(F) DisA^WT、DisA^AcP、DisA^K66Q和DisA^K66R蛋白的交聯(lián)實(shí)驗(yàn)。
(G) DisA^WT、DisA^K66Q和DisA^K66R蛋白的DAC活性。
 
（2）DisA主要在K66位點(diǎn)乙?；瘯r(shí)失活
通過構(gòu)建DisA的K66突變體（K66Q和K66R），研究發(fā)現(xiàn)K66Q突變體的八聚體結(jié)構(gòu)顯著減少，DAC活性亦顯著降低，而K66R突變體表現(xiàn)出與野生型相似活性。這表明K66位點(diǎn)乙?；荄isA失活的主要原因。此外，過表達(dá)DisAK66Q的菌株中c-di-AMP水平顯著降低，進(jìn)一步驗(yàn)證K66乙酰化對(duì)c-di-AMP合成的抑制作用。
 
圖2：K66乙酰化對(duì)體內(nèi)c-di-AMP合成的影響。
  (A)  S. erythraea野生型（WT）、過表達(dá)DisAWT（OdisA^WT）、過表達(dá)DisAK66Q（OdisA^K66Q）和過表達(dá)DisAK66R（OdisA^K66R）菌株在30°C下TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線。
(B) 在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的WT、OdisA^WT、OdisA^K66Q和OdisA^K66R菌株中disA基因的轉(zhuǎn)錄水平。
(C) 在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的WT、OdisA^WT、OdisA^K66Q和OdisA^K66R菌株的細(xì)胞提取物中細(xì)胞內(nèi)的c-di-AMP水平。
 
（3）AcP依賴的乙酰化通過失活DasR消除對(duì)disA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
研究發(fā)現(xiàn)，DasR是disA基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子，而AcP能夠乙酰化DasR并影響其功能。在氮限制條件下，DasR乙?；斤@著升高，且AcP能夠直接乙?；疍asR。乙?；笵asR的DNA結(jié)合能力顯著減弱，從而消除對(duì)disA的轉(zhuǎn)錄抑制，導(dǎo)致c-di-AMP水平升高。 圖3：AcP誘導(dǎo)的DasR乙?；钄嗥銬NA結(jié)合活性。
  (A) 在氮充足（N⁺）或氮限制（N^-）條件下，S. erythraea WT菌株中DasR乙酰化水平。
(B) 在37°C下，使用10 mM AcP對(duì)His標(biāo)簽的DasR蛋白不同時(shí)間點(diǎn)（0、1、3和5h）乙?；幚怼Ｍㄟ^Western blotting使用特異性抗乙酰賴氨酸（anti-AcK）抗體檢測(cè)乙?；?。
(C) DasR野生型（DasR^WT）和乙?；疍asR（DasR^AcP）與目標(biāo)基因disA啟動(dòng)子的結(jié)合電泳遷移率變化分析（EMSA）。
(D) DasR野生型（DasR^WT）和乙酰化DasR（DasR^AcP）蛋白的圓二色光譜（CD）圖。
(E) DasR的結(jié)構(gòu)域組織以不同顏色的方框表示。
(F) DasR及其突變體與目標(biāo)基因disA啟動(dòng)子的結(jié)合EMSA分析。
(G) 純化的His-DasR、DasR^AcP、DasR^K78Q和DasR^K78R與disA基因啟動(dòng)子的結(jié)合BLI實(shí)驗(yàn)。
(H) DasR及其突變體的交聯(lián)實(shí)驗(yàn)。
 
（4）DasR的K78位點(diǎn)乙?；龠M(jìn)disA轉(zhuǎn)錄和c-di-AMP合成
質(zhì)譜分析鑒定出DasR的K78為關(guān)鍵乙?；稽c(diǎn)。通過構(gòu)建DasR的K78突變體（K78Q和K78R），研究發(fā)現(xiàn)K78Q突變體的DNA結(jié)合能力顯著減弱，而K78R突變體則表現(xiàn)出與野生型相似的活性。ChIP-seq分析顯示，K78乙?；@著降低了DasR在disA啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力，從而消除對(duì)disA的轉(zhuǎn)錄抑制，促進(jìn)c-di-AMP的合成。
  圖4：K78乙?；隗w內(nèi)消除DasR介導(dǎo)的對(duì)disA的抑制作用。
  (A) ChIP-seq信號(hào)密度在peaks中心和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（±2 kb）熱圖。顯示了平均信號(hào)強(qiáng)度。紅色表示信號(hào)強(qiáng)度低，藍(lán)色表示信號(hào)強(qiáng)度高。
(B) 指定菌株中的ChIP-seq信號(hào)。
(C) 在指定菌株中，disA啟動(dòng)子區(qū)域的ChIP-seq信號(hào)的整合基因組瀏覽器（IGV）軌跡。
(D) 指定菌株中disA的轉(zhuǎn)錄水平。倍數(shù)變化表示與DasR野生型（DasR^WT）菌株相比的表達(dá)水平。
(E) 指定菌株中細(xì)胞內(nèi)的c-di-AMP水平。
 
（5）c-di-AMP穩(wěn)態(tài)介導(dǎo)多細(xì)胞分化
研究發(fā)現(xiàn)，c-di-AMP水平變化對(duì)S. erythraea菌發(fā)育和孢子形成具有顯著影響。過表達(dá)DisA^K66Q的菌株表現(xiàn)出延遲的孢子形成，而過表達(dá)DisA^K66R菌株則表現(xiàn)出過度孢子形成。這表明c-di-AMP水平升高促進(jìn)了孢子形成，而K66位點(diǎn)乙?；瘎t抑制這一過程。此外，DasR的K78乙?；餐ㄟ^調(diào)控c-di-AMP水平影響孢子形成。
  圖5：AcP誘導(dǎo)的乙酰化影響孢子形成。
  S. erythraea野生型（WT）、過表達(dá)DisA^K66Q（OdisA^K66Q）、過表達(dá)DisA^K66R（OdisA^K66R）、過表達(dá)DasR^K78Q（OdasR^K78Q）和過表達(dá)DasR^K78R（OdasR^K78R）菌株在30°C下于R2YE agar上培養(yǎng)96小時(shí)后的掃描電子顯微照片。圖像放大倍數(shù)為×5000。兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中結(jié)果相似的代表性圖片。
 
（6）AcP與c-di-AMP穩(wěn)態(tài)之間的生理聯(lián)系保守
通過序列比對(duì)分析，研究發(fā)現(xiàn)DisA的K66和DasR的K78位點(diǎn)在多種放線菌中高度保守。這表明AcP依賴的乙?；{(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的機(jī)制在放線菌中具有廣泛的保守性，可能對(duì)放線菌的生長(zhǎng)發(fā)育和抗生素合成具有普遍的調(diào)控作用。
 
圖6：放線菌中DasR和DisA蛋白的序列比對(duì)。
  對(duì)以下物種的DisA（A）和DasR（B）蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)：青鏈霉菌（Streptomyces lividans）、天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）、阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）、灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）、紅孢鏈霉菌（Streptosporangium roseum）、熱單胞菌（Thermomonospora curvata）以及紅色糖多孢菌（S. erythraea）。所有物種中保守的賴氨酸殘基以紅色加粗顯示。
 
討論
本研究揭示了AcP依賴的乙酰化修飾網(wǎng)絡(luò)在調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)中的重要作用。AcP通過乙酰化修飾DisA和DasR，直接或間接調(diào)控c-di-AMP的合成與降解。這種調(diào)控機(jī)制不僅在紅色糖多孢菌中存在，還在其他放線菌中具有廣泛的保守性。此外，c-di-AMP水平的變化對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)發(fā)育和抗生素合成具有顯著影響，表明c-di-AMP穩(wěn)態(tài)調(diào)控對(duì)于放線菌的生理功能至關(guān)重要。未來的研究可以進(jìn)一步探索AcP依賴的乙?；揎椩谄渌?xì)菌中的作用機(jī)制，以及如何通過調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)來優(yōu)化抗生素生產(chǎn)菌株。

ChIP-seq在本研究中的重要作用
本研究通過ChIP-seq分析，研究者精確地定位DasR在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，驗(yàn)證了DasR對(duì)disA基因的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，ChIP-seq數(shù)據(jù)還揭示了AcP依賴的乙?；绾瓮ㄟ^影響DasR的DNA結(jié)合能力來調(diào)控c-di-AMP合成，為研究c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制提供重要依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：
Fu Y, Zhao L-C, Shen J-L, Zhou S-Y, Yin B-C, Ye B-C, You D. A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria. mBio. 2024 Jul 9:e0141124. doi: 10.1128/mbio.01411-24.