病毒污染是使用源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的生物技術(shù)產(chǎn)品的潛在風(fēng)險(xiǎn)。生產(chǎn)過程中，無論處于臨床前非GMP、臨床GMP或商業(yè)化階段，均可能受到內(nèi)源性或外源性病毒的污染，對患者安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，過去36年間共報(bào)告了26起哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒污染事件，其發(fā)生在產(chǎn)品生命周期的所有階段。因此，確保產(chǎn)品病毒安全性是行業(yè)監(jiān)管與工藝開發(fā)的核心關(guān)注點(diǎn)。

為了保證這些產(chǎn)品在潛在病毒污染方面的安全性，監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求進(jìn)行病毒清除研究，以評估純化過程清除內(nèi)源性和外源性病毒的能力。一般來說，下游工藝減少病毒是通過柱層析和專用的病毒去除步驟（即低pH值孵育、去污劑處理和納濾）來實(shí)現(xiàn)的。本文將簡述陰離子層析（Anion exchange chromatography, AEX）病毒去除效果及影響因素。

AEX病毒去除機(jī)理與能力
在下游純化工藝中，層析步驟除有效去除工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)外，亦是重要的病毒清除單元操作。其中，AEX常被證明是病毒清除最為關(guān)鍵的步驟。 AEX病毒去除機(jī)理
AEX用于抗體類項(xiàng)目純化時(shí)，主要采用兩種模式：

? 流穿模式 (Flow Through Mode, FT)：此模式利用目標(biāo)單抗與模型病毒等電點(diǎn)（PI）的差異。多數(shù)單抗pI較高，在適宜的緩沖液條件下（pH 7.0~8.5，低電導(dǎo)率），單抗因帶正電荷而流穿；而模型病毒（如X-MuLV pI~5.8, MVM pI~6.2）在此條件下帶負(fù)電荷，通過與填料帶正電荷的配基發(fā)生靜電吸附而被去除。

? 結(jié)合-洗脫模式 (Bind and Elute Mode, B/E)：此模式則利用單抗與病毒在結(jié)合力強(qiáng)度上的差異。在特定條件下，單抗和病毒均結(jié)合至填料上，隨后通過改變洗脫條件，選擇性地洗脫單抗，而病毒仍保留在填料上。

AEX色譜病毒去除能力
大量數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)T模式AEX能有效去除包膜病毒和非包膜病毒，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明（如Fig.1）：

? 約70%的AEX應(yīng)用采用FT模式，約30%采用B/E模式。
? FT模式對兩種病毒表現(xiàn)出較高的穩(wěn)健性，且批次間變異性較低。
? B/E模式對兩種病毒的清除能力呈現(xiàn)更高的批次間變異性。
? 兩種模式下細(xì)小病毒批次間變異性均大于逆轉(zhuǎn)錄病毒。

Fig.1 陰離子交換層析對逆轉(zhuǎn)錄病毒和細(xì)小病毒的去除能力總結(jié)（FDA數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)）

復(fù)合模式陰離子層析病毒去除能力
復(fù)合模式層析填料同時(shí)具有離子交換與疏水相互作用等多種作用力，這種多模式機(jī)制賦予了其獨(dú)特的優(yōu)勢：

? 增強(qiáng)緩沖液的兼容性：可在更寬的pH值和電導(dǎo)率范圍內(nèi)有效運(yùn)行。

? 更穩(wěn)健的病毒清除：如Fig.2所示，與單一模式AEX相比，復(fù)合模式AEX在高鹽條件下仍能維持優(yōu)異的細(xì)小病毒去除效能（在高鹽區(qū)仍保持較高LRV）。

Fig.2 復(fù)合模式陰離子層析 vs. 單一陰離子層析對細(xì)小病毒的去除能力比較（FDA數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)）

  AEX病毒去除能力的關(guān)鍵影響因素
病毒-介質(zhì)相互作用強(qiáng)度可能受到病毒等電點(diǎn)（pI）與溶液pH值、溶液鹽濃度、Mab性質(zhì)、病毒上可用結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量以及競爭物存在等因素相互作用的的影響。

? pH值：病毒-AEX的相互作用為靜電，但在低鹽條件下，X-MuLV在不同pH下清除效果比較穩(wěn)定，X-MuLV和AEX填料之間的相互作用在5.0~8.0的范圍內(nèi)僅略微依賴于pH值。與X-MuLV 清除率不同，不同pH值的MVM(pI 6.2)去除符合預(yù)期，當(dāng)50 mM氯化鈉的pH值從5增加到8時(shí)，LRV大約增加4。
? 離子強(qiáng)度：對于單一的陰離子層析，通常隨著鹽濃度增加，病毒去除效果逐漸降低。而復(fù)合模式層析受鹽濃度影響較小，由Fig.2可知。
? Mab性質(zhì)：對于任何給定類型的色譜分析，特定病毒的清除率不僅受色譜形成條件的影響，還受目標(biāo)mAb本身的影響，病毒可以通過其表面負(fù)電荷與帶正電荷的mAb相互作用，從而影響病毒的去除效果。
? 病毒種類：X-MuLV的pI為5.8，該現(xiàn)象（X-MuLV在pH值為5時(shí)與AEX介質(zhì)結(jié)合）是不正常的，表明該病毒在該pH值時(shí)其表面仍舊含有帶負(fù)電荷的斑塊。可知pI是預(yù)測病毒等大型復(fù)雜結(jié)構(gòu)與離子交換（IEX）填料相互作用是不足的。相反，在確定病毒-IEX 填料相互作用方面，病毒表面電荷分布比 pI 更相關(guān)。

綜上可知，陰離子層析對病毒的去除效果受到多種因素影響，因此為獲得穩(wěn)健的病毒清除效果，單一模式陰離子層析建議pH 值為7.0~8.5、電導(dǎo)率<10 mS/cm和載量<100 mg/ml。

博格隆陰離子填料病毒去除能力數(shù)據(jù) 復(fù)合模式陰離子填料 Diamond MIX-A

? 高效清除能力：在某項(xiàng)目中，針對多種包膜和非包膜病毒模型（X-Mulv, MVM, PRV, Reo3）Diamond MIX-A展現(xiàn)出優(yōu)異的清除能力，LRV范圍達(dá)4.5-5.34 log。
? 卓越耐鹽性：在極具挑戰(zhàn)性的高鹽條件下（上樣電導(dǎo)22 mS/cm, pH 6.43, 載量~60 mg/mL），保留時(shí)間（5 min），Diamond MIX-A對X-Mulv仍實(shí)現(xiàn)了顯著的清除效果，LRV分別達(dá)到3.04 log、3.25 log，驗(yàn)證了其在高鹽環(huán)境下的穩(wěn)健性。

強(qiáng)陰離子交換填料Diamond Q系列

下表匯總了Diamond Q系列填料在多個(gè)單抗項(xiàng)目中對模型病毒X-MuLV和MVM的清除表現(xiàn)：

? Diamond Q對逆轉(zhuǎn)錄病毒X-MuLV展現(xiàn)出高度一致且優(yōu)異的清除能力（所有項(xiàng)目LRV≥4 log）。
? 對細(xì)小病毒MVM的清除能力存在一定的項(xiàng)目間變異性（LRV范圍從2~5 log），這也印證了前文所述。盡管如此，在多數(shù)項(xiàng)目中仍能達(dá)到≥3 log的有效清除。
? Diamond Q Mustang 在測試項(xiàng)目中同樣表現(xiàn)出良好的病毒清除能力。

總結(jié)
下游純化工藝中各層析步驟在病毒清除方面具有不同的能力和穩(wěn)健性水平。陰離子交換層析（AEX），尤其是流穿模式（FT），已被廣泛證明是清除病毒的關(guān)鍵單元操作。

然而，即使是通常被認(rèn)為穩(wěn)健的AEX步驟，其清除效果（特別是對細(xì)小病毒）也可能因目標(biāo)Mab的特異性、工藝參數(shù)的選擇而存在差異。復(fù)合模式AEX填料（如Diamond MIX-A）因其結(jié)合了多種作用力，在高鹽條件下展現(xiàn)出更穩(wěn)健的病毒清除性能。

為確保病毒清除的穩(wěn)健性，需在經(jīng)過驗(yàn)證的操作參數(shù)范圍內(nèi)運(yùn)行AEX。病毒清除研究應(yīng)使用代表性的模型病毒，并在工藝最差條件的情況下進(jìn)行，以充分證明該步驟在各種潛在風(fēng)險(xiǎn)場景下均能提供可靠且符合監(jiān)管要求的病毒去除能力。

參考文獻(xiàn)

[1] Barone, P.W., et al. Viral contamination in biologic manufacture and implications for emerging therapies. Nat Biotechnol 38, 563–572 (2020). (Updates the scope and context of viral risk).

[2] Ajayi, O.O., et al. An updated analysis of viral clearance unit operations for biotechnology manufacturing. Curr Res Biotechnol 4, 190-202 (2022). (Provides a modern overview of unit operations, including AEX).

[3] CAI, K., et al. Virus removal robustness of ion exchange chromatography. Biologicals 60, 64-70 (2019). (Specifically addresses robustness factors for IEX virus clearance, critical for the discussion on variability).

[4] Li, Y. Viral removal by column chromatography in downstream processing of monoclonal antibodies. Protein Expr Purif 198, 106131 (2022). (Focuses on chromatography for mAbs, directly supporting the application context).

關(guān)于博格隆
博格隆成立于2008年，是一家專注于為分離純化提供高質(zhì)量層析介質(zhì)的高新技術(shù)企業(yè)，是中國較早具備大規(guī)模生產(chǎn)分離純化介質(zhì)能力的企業(yè)之一。博格隆所提供的產(chǎn)品涵蓋各類分離純化介質(zhì)、預(yù)裝柱、實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)級空柱、微載體，同時(shí)提供分離純化工藝開發(fā)服務(wù)及填料定制。