大家都曉得 ROS，活性氧嘛......但但但但但是，它可并非是一種單分子，而是一類總稱！那么，ROS 都包含哪些？當真集百害而無一利？與多種疾病相關的 ROS 又該如何檢測？？？

Section.01
活性氧 (ROS): 一類總稱

首先，大家所熟知的活性氧—— ROS，并不是單個分子的名稱，而是含氧原子的高反應性化合物的總稱！

如圖 1 所示，ROS 可以是中性分子，如 H₂O₂；離子，如超氧陰離子 O₂?^- ；或自由基，如羥基自由基?OH；當然也可以是單線態氧 ¹O₂ 。其中，羥基自由基?OH 為自由基，其余則為非自由基^[1]。不同 ROS 的形成升高導致分子損傷，稱為“氧化應激”。O₂?^- 由 O₂ 還原而成，是其他 ROS 的前體。例如，O₂?^- 分解形成 H₂O₂，H₂O₂ 與亞鐵化合物和相關還原劑發生 Fenton 反應或 Haber-Weiss 反應進一步還原為?OH^[2][3]。

圖 1. 活性氧 ROS 的電子式及轉換 ^[2][3] 。 
A．活性氧的電子式。超氧陰離子 (O ₂ ? ^- )、過氧化氫 (H ₂ O ₂ )、羥基自由基 (?OH) 和單線態氧 ( ¹ O ₂ ) 的電子式 (從左上到右下)。圖中還顯示了分子氧的電子式以供比較。B. 活性氧反應性強，可迅速轉換。值得注意的是，超氧陰離子（O ₂ ? ^- ）是不穩定的，在超氧化物歧化酶（SOD）的作用下會迅速變成過氧化氫 (H ₂ O ₂ )。如果陰離子與一氧化氮 (NO) 反應，則形成過氧亞硝酸鹽 (ONOO ^- )。單線態氧（ ¹ O ₂ ）可由次氯酸（HOCI）與 H ₂ O ₂  反應生成。

ROS：呼吸作用的副產物

ROS 由各種細胞區室產生，包括細胞質、細胞膜、內質網、線粒體和過氧化物酶體。在這些區室中，線粒體是 ROS 產生的主要貢獻者，它們產生了大約 90% 的細胞 ROS  (圖 2) ^[4][5] 。在正常的氧代謝過程中，ATP 合成會產生 ROS。因此，在大多數情況下，ROS 被認為是呼吸作用的副產物。

除此之外，內源性 ROS 產生的機制還包括內質網應激和未折疊蛋白反應、過氧化物酶體的代謝反應、NADPH 氧化酶 2 系統和酶促反應等。當然，暴露于某些有害因素，如某些外源性藥物、感染因子、污染、紫外線、香煙煙霧和輻射，也可能導致 ROS 的產生。
 
圖 2. 線粒體活性氧 (ROS) 的主要來源 ^[5] 。
線粒體呼吸鏈 (MRC) 由四種酶復合物 (I-IV) 組成。Krebs 循環中 NADH 和 FADH 2 提供的電子分別在復合物 I 和 II 處轉移，并依次轉移至復合物 III 和 IV。該電子轉移與跨內膜的質子轉運偶聯，產生質子梯度，從而允許 ADP 通過 ATP 合酶（復合物 V）進行磷酸化。氧代謝產生超氧化物陰離子 (?0 ₂ ^?  )，超氧化物歧化酶 (SOD) 將其轉化為過氧化氫 (H ₂ O ₂ )，然后在一些抗氧化酶防御機制（例如過氧化氫酶 (CAT) 或谷胱甘肽過氧化物酶 (GPx) 還原酶 (GPr) 系統）的作用下轉化為水。過量的 ROS 產生會氧化蛋白質、脂質或線粒體 DNA (mtDNA)，最終導致線粒體功能障礙和細胞死亡。

“雙刃劍”：ROS 的兩面性

你可能不了解 ROS，但你一定聽過護膚品的宣傳詞，什么抗老抗氧化，清除自由基，新升級自由基智感防御…… blabla~~

的確！過量 ROS 對身體大有害處。 然鵝！在正常的細胞環境中，ROS 對生命至關重要。

一方面， ROS 具有高反應性，很容易與幾乎所有類型的生物分子發生反應。過量 ROS 通過氧化生物分子， 如細胞膜脂質、組織蛋白質或酶、碳水化合物和 DNA 等 引起氧化應激，導致細胞損傷。此外，ROS 可導致多種病理，癌癥、心血管疾病和神經系統疾病都顯示出 ROS 參與。 另一方面， 其參與不同的生物功能，低至中等濃度的 ROS 通過調節細胞信號級聯發揮作用。例如通過氧化還原調節蛋白質磷酸化、離子通道和轉錄因子。某些生物合成過程也需要 ROS，包括甲狀腺激素的產生和細胞外基質的交聯等 ^[1][3] 。此外，神經傳遞、血小板聚集、血壓調節、免疫系統控制、學習和記憶、細胞生長調節、重要生物化合物的合成和外源代謝都與 ROS 有關。

表 1. 活性氧在各種疾病中的作用^[6]。
 
So！在 ROS 如此熱門的研究態勢下，更深入地了解其作用機制，便是重中之重。Buttttt，活性物質嘛，總是難以檢測，譬如壽命很短，體內存在的抗氧化劑種類繁多等。不過！結合使用合適的熒光探針，可是測量 ROS 的一種極好的方法。

Section.02
活性氧 (ROS):  檢測方案

本部分主要介紹 ROS 的熒光檢測方法！

不同種類的 ROS 應該選取哪種熒光探針？激發/發射波長、反應物誘導的熒光變化和主要應用都有哪些？ 如表 2 所示，小 M 為大家整理了 23 種熒光探針的相關信息（可登錄 MCE 官網、公眾號后臺私信 或聯系銷售 購買）， 大家點贊收藏，按需自取喔~

表 2. 不同熒光探針的 ROS 檢測方案^[1]。
 
超氧化物自由基（O₂?^-) 檢測

提到超氧化物 (O₂?^-)，就得先聊聊熒光探針  Dihydroethidium (DHE，又稱 Hydroethidine, HE, HY-D0079) ！其主要檢測 O₂?^-。由于 O₂?^- 通常是占比最高的 ROS 成分，DHE 也被廣泛用于 ROS 的檢測。未氧化形式下，DHE 產生固有的藍色熒光 (Ex/Em=370/420 nm)，當 DHE 被 O₂ 氧化時，產生了一種熒光化合物乙錠 (E⁺)，可嵌入 DNA 的雙螺旋結構中，形成乙錠-DNA 復合物，產生紅色熒光^[1][7]。
  圖 3. Hydroethidine (HE) 和 ethidium (E ⁺ ) 的化學結構 ^[1] 。
 

• DHE 實驗指南

實驗步驟^[7]

1. 溶液配制

（1）制備儲存液
用無水 DMSO 配制 10 mM 的 DHE 儲備液  (1mg DHE 溶于0.317 mL DMSO 中) 。

（2）工作液的配置
用預熱好的無血清細胞培養基或 PBS 稀釋儲存液，配制成 1-10 μM 的 DHE 工作液（ 請根據實際情況調整 DHE 工作液的濃度）。

2. 細胞染色 (懸浮細胞)

（1）1000 g 離心 3-5 分鐘，棄上清。PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。
（2）加入 1 mL Dihydroethidium 工作液，室溫孵育 30 分鐘。
（3）4℃，400 g 離心 3-4 分鐘，棄上清。
（4）PBS 洗滌 2 次，每次 5 分鐘。
（5）用無血清細胞培養基或 PBS 重懸細胞，熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。

3. 細胞染色 (貼壁細胞)

（1）將貼壁細胞培養于無菌蓋玻片上。
（2）從培養基中移出蓋玻片，吸除多余培養基。
（3）加入 100 μL 染料工作液，輕輕晃動使其完全覆蓋細胞，孵育 30 分鐘。
（4）吸去染料工作液，用培養基洗 2-3 次，每次 5 分鐘 ，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察（ 若需要用流式細胞儀檢測，需將細胞用胰蛋白酶消化重懸后再進行染色）。

實驗結果

圖 4A 為 DHE 細胞染色結果，檢測樣本為 U87 細胞,使用 DHE 5 μM 避光染色 30 min^[8]。 圖 4B-C 為 DHE 組織染色結果，圖 4B 檢測樣本為小鼠大腦冰凍切片,使用 DHE 10 μM 避光染色 1 h^[9]。圖 4C 檢測樣本為小鼠視網膜石蠟切片,使用 DHE 5 μM 避光染色 20 min，設置了超氧化物歧化酶處理組以驗證是否存在非特異干擾^[10]。
 


圖 4. DHE 細胞和組織染色結果 ^[8][9][10]。

熒光探針檢測 H₂O₂

如圖 5 所示，DCFH 氧化生成 DCF，一種熒光化合物，最初被認為是檢測H₂O₂ 的特定指示劑。然而，已經證明 DCFH 可以被其他 ROS 氧化。 DCFH-DA  (DCFH二乙酸形式, H2DCFH-DA, HY-D0940)  可以應用于細胞研究，因為它能夠通過細胞膜擴散，然后被細胞內酯酶酶解成 DCFH。隨后，被多種 ROS 氧化 的 DCFH 生成綠色熒光的 DCF，被廣泛應用于總 ROS 的檢測^[1][11][12]。
 
圖 5. DCFH DA 脫酯化生成 DCFH，以及 ROS 和 RNS 進一步氧化生成熒光 DCF 的示意圖 ^[1] 。
 

• H2DCFDA 實驗指南

實驗步驟^[7]

1. 溶液配制

（1） 制備儲存液
用無水 DMSO 配制 10 mM 的 H2DCFDA 儲備液 (5 mg 粉末加入 1.026 mL DMSO)。

（2）工作液的配制
用預熱好的無血清細胞培養基或 PBS 稀釋儲存液，配制成 1-10 μM 的 H2DCFDA 工作液（請根據實際情況調整 H2DCFDA 工作液濃度，且現用現配）。

2. 細胞染色 (懸浮細胞)

（1）1000 g 離心收集細胞，加入 PBS 洗滌兩次，每次 5 分鐘。
（2）加入 1 mL 染料工作液，室溫孵育 5-30 分鐘。
（3）400 g 離心 3-4 分鐘，棄去上清。
（4）加入 PBS 洗滌細胞兩次，每次 5 分鐘。
（5）用 1 mL 無血清培養基或 PBS 重懸細胞后，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察。

3. 細胞染色 (貼壁細胞)

（1）將貼壁細胞培養于無菌蓋玻片上。
（2）從培養基中移出蓋玻片，吸除多余培養基。
（3）加入 100 μL 染料工作液，輕輕晃動使其完全覆蓋細胞，孵育 5-30 分鐘。
（4）吸去染料工作液，用培養基洗 2-3 次，每次 5 分鐘 ，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察（若需要用流式細胞儀檢測，需將細胞用胰蛋白酶消化重懸后再進行染色）。

實驗結果

圖 6A 為 DHE 細胞染色結果，檢測樣本為 4T1 細胞，H2DCFDA 5 μM 避光染色 30 min^[13]。 圖 6B 為 DHE 組織染色結果，檢測樣本為活體海馬切片,使用 H2DCFDA 10 μM 避光染色 30 min^[14]。

圖 6. H2DCFDA 細胞和組織染色結果 ^[13][14] 。

線粒體超氧化物（O₂?^-) 指示劑

線粒體有氧代謝是 ROS 的主要來源之一，不過也有少量 ROS 是NAD(P)H 氧化酶、細胞色素 P450 單加氧酶等產生的。在研究線粒體相關疾病機制，或評估線粒體靶向藥物效果時常需要聚焦于單獨的線粒體 ROS，這該如何是好？

莫慌，  MitoSOX Red (HY-D1055)  就能夠避免其他來源 ROS 的干擾，直接反映線粒體的超氧化物生成狀態。MitoSOX Red 可以穿透細胞膜，通過線粒體膜電位依賴性的方式積聚在線粒體中，并被其中的超氧化物氧化，氧化產物與線粒體核酸結合發出強烈熒光 (Ex/Em=510/580 nm)^[15][16]。 
 

• MitoSOX Red 實驗指南

實驗步驟^[15][16]

1. 溶液配制

（1）制備儲存液
用無水 DMSO 配制 5 mM 的 MitoSOX Red 儲備液  (50 μg 粉末加入 13 μL DMSO) 。

（2）工作液的配制
用預熱好的無血清細胞培養基或 PBS 稀釋儲存液，配制成 1-10 μM 的 MitoSOX Red 工作液 （ 請根據實際情況調整 MitoSOX Red 工作液濃度，且現用現配 ） 。

2. 細胞染色 (懸浮細胞)

（1）4℃ 1000 g 離心收集細胞，加入 PBS 洗滌兩次，每次 5 分鐘。細胞密度為 1×10 ⁶ /mL。
（2）加入 1 mL 染料工作液，室溫孵育 5-30 分鐘。
（3）4℃ 400 g 離心 3-4 分鐘，棄去上清。
（4）加入 PBS 洗滌細胞兩次，每次 5 分鐘。
（5）用 1 mL 無血清培養基或 PBS 重懸細胞后，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察。

3. 細胞染色 (貼壁細胞)

（1）將貼壁細胞培養于無菌蓋玻片上。
（2）從培養基中移出蓋玻片，吸除多余培養基。
（3）加入 100 μL 染料工作液，輕輕晃動使其完全覆蓋細胞，孵育 5-30 分鐘。
（4）吸去染料工作液，用培養基洗 2-3 次，每次 5 分鐘 ，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行觀察（ 若需要用流式細胞儀檢測，需將細胞用胰蛋白酶消化重懸后再進行染色）。

實驗結果

圖 7 為 MitoSOX Red 細胞染色結果，檢測樣本為 Huh7 細胞,使用 5 μM MitoSOX Red 避光染色 30 min^[17]。
 
圖 7. MitoSOX Red 細胞染色結果示例 ^[17] 。

注意事項:

• 避光操作：DHE 儲存液、H2DCFDA 儲存液、MitoSOX Red 儲存液建議分裝后在 -20℃ 或 -80℃ 避光保存，避免反復凍融。同時，實驗全程也需要避光操作，溶解、孵育、洗滌和成像需要在暗環境中進行，必要時可用鋁箔等包裹樣品。
• 含核酸樣本：DHE 的熒光依賴于與核酸的結合，所以不能用于不含核酸的溶液樣本的 ROS 檢測。
• 及時觀察：H2DCFDA 和 MitoSOX Red 在染色后需要盡快觀察，并且染色后也不可固定細胞。
• 活細胞染色：H2DCFDA 和 MitoSOX Red 只適用于活細胞染色，DHE 推薦用于未固定的新鮮切片或活細胞（雖然 DHE 可以嘗試用于固定切片的染色，但是活細胞染色 DHE 后不可固定細胞）。
• 也有部分文獻將 DHE 用于石蠟切片，因為固定操作對 ROS 有一定的影響，固定時間、染色濃度等條件都需要根據實際樣本情況做調整，總體的染色效果往往也不如未固定的樣本，也有可能難以做出理想的效果，實在有固定切片染色需要的小伙伴可以參考上面圖 4 的組織染色示例摸索一下，并且建議設置超氧化物歧化酶處理組等實驗組來排除可能存在的非特異染色干擾~

 
Section.03
小結

好啦，本期干貨較多，需要的小伙伴們記得點贊收藏~ 此外，許多小伙伴會問到關于組織切片的染色問題，需要注意固定的操作可能破壞細胞內 ROS 的分布，小 M 優先建議使用無固定的冰凍切片或活體切片，在切片后盡快進行染色觀察，組織染色的實驗難度相對較大，需要摸索的條件 (切片條件、染色濃度時間等) 相對較多，可以參考細胞染色的濃度和時間摸索一下切片染色的效果，并且做好無處理對照減少自發熒光等因素的干擾~
 

產品推薦

HY-D0940，適合活細胞泛 ROS 檢測、綠色熒光通道觀測。

Dihydroethidium (DHE) HY-D0079，適合超氧化物檢測、紅色熒光通道觀測、有部分固定切片染色的文獻參考。

MitoSOX Red  HY-D1055，適合靶向線粒體的超氧化物檢測、橙紅色熒光通道觀測。

HKPerox-2  HY-D1157，適合活細胞內 H2O2 檢測的高靈敏度綠色熒光探針。

HKGreen-4I  HY-D1148，適合活細胞內 ONOO- 檢測的高靈敏度綠色熒光探針。

HKOH-1 HY-D1151，適合活細胞內 ?OH 檢測的高靈敏度綠色熒光探針。

 

[1] Gomes A, et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 2005 Dec 31;65(2-3):45-80. 
[2] Kakizawa S. Involvement of ROS signal in aging and regulation of brAIn functions. J Physiol Sci. 2025 Mar;75(1):100003.
[3] Brieger K,et al. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly. 2012 Aug 17;142:w13659. 
[4] Tirichen H,et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species and Their Contribution in Chronic Kidney Disease Progression Through Oxidative Stress. Front Physiol. 2021 Apr 23;12:627837. 
[5] García-García, Francesc Josep et al. Nutrition, Bioenergetics, and Metabolic Syndrome. Nutrients vol. 12,9 2785. 11 Sep. 2020.
[6] Yang S, Lian G. ROS and diseases: role in metabolism and energy supply. Mol Cell Biochem. 2020 Apr;467(1-2):1-12. doi: 10.1007/s11010-019-03667-9. Epub 2019 Dec 7. Erratum in: Mol Cell Biochem. 2020 Apr;467(1-2):13.
[7] Zielonka J, et al. Global profiling of reactive oxygen and nitrogen species in biological systems: high-throughput real-time analyses. J Biol Chem. 2012 Jan 27;287(5):2984-95.
[8] Wang T, et al. SIRT5-mediated BCAT1 desuccinylation and stabilization leads to ferroptosis insensitivity and promotes cell proliferation in glioma. Cell Death Dis. 2025 Apr 7;16(1):261. 
[9] Wang B, et al. Dexpramipexole Attenuates White Matter Injury to Facilitate Locomotion and Motor Coordination Recovery via Reducing Ferroptosis after Intracerebral Hemorrhage. Oxid Med Cell Longev. 2022 Aug 4;2022:6160701. 
[10] Santana-Garrido á, et al. Retinoprotective Effect of Wild Olive (Acebuche) Oil-Enriched Diet against Ocular Oxidative Stress Induced by Arterial Hypertension. Antioxidants (Basel). 2020 Sep 18;9(9):885.
[11] Gomes A, et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 2005 Dec 31;65(2-3):45-80. 
[12] Lyublinskaya OG, et al. Redox environment in stem and differentiated cells: A quantitative approach. Redox Biol. 2017 Aug;12:758-769.
[13] Han W, et al. Self-Sustained Biophotocatalytic Nano-Organelle Reactors with Programmable DNA Switches for Combating Tumor Metastasis. Adv Mater. 2025 Mar;37(9):e2415030. 
[14] Feeney CJ, et al. Vulnerability of glial cells to hydrogen peroxide in cultured hippocampal slices. Brain Res. 2008 Mar 10;1198:1-15.
[15] Price OT, et al. Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker Red. Cytometry A. 2003;53(1):9-21. 
[16] Fengjiao Jin, et al. The PI3K/Akt/GSK-3β/ROS/eIF2B pathway promotes breast cancer growth and metastasis via suppression of NK cell cytotoxicity and tumor cell susceptibility. Cancer Biol Med. 2019 Feb;16(1):38-54. 
[17] Yu T, et al. SIRT7-mediated NRF2 deacetylation promotes antioxidant response and protects against chemodrug-induced liver injury. Cell Death Dis. 2025 Apr 1;16(1):232.