使用MANTIS?液體處理器，解決了處理單細胞樣品特有的問題，提高了新工作流程的定量準確性

量化單個哺乳動物細胞中蛋白質歷來依靠免疫抗體技術，如CyTOF、單細胞免疫印跡和鄰近延伸試驗。盡管有效，但這些方法在生產通量上受到限制，且它們的準確性可能由于缺乏高度特異性抗體而降低。此外，和任何用于研究細胞的免疫分析方法一樣，這些技術都面臨著與細胞通透性和表位可及性相關的挑戰。

為了解決這些問題，東北大學斯拉沃夫實驗室的研究人員最近開發了單細胞蛋白質組學質譜 (SCoPE-MS)，這是一種使用同位素標記定量 (TMT)標記單細胞多肽的技術。通過在納米液相色譜分離之前將標記的肽與標記的載體肽混合， SCoPE-MS被證明可以極大地減少樣品損失——當處理低豐度材料時如單細胞時，這是一個關鍵的考慮因素。對小鼠胚胎干細胞分化中的1000多種蛋白質進行定量分析，并將這些數據與mRNA表達進行比較，不僅為SCoPE-MS定 量表征單細胞基因調控奠定了基礎，并且強調了它根據蛋白質組對細胞進行分類的潛力。

隨著自動化和小型化樣品制備的引入2，SCoPE-MS已經發展成為SCoPE2。除了提供更好的定量精度外，SCoPE 2有利于降低成本、減少操作時間，顯著提高樣品制備和測量的通量。MANTIS?液體處理器(圖1)是這一成功的關鍵，提供了可靠的亞微升容量分配，甚至是出了名難分配的液體，如用于存儲TMT的100%乙腈。

圖1：MANTIS?液體處理器

單細胞樣品處理的獨特挑戰

樣本低通量是單細胞研究人員面臨的主要問題。一個“正常”的哺乳動物細胞的蛋白質組通常 只有50-500pg，質量上限為廣泛使用的HeLa細胞系，而像單核細胞這樣的細胞含有較少的蛋白質。因此，進行一項實驗需要將數十個、數百個甚至數千個樣品結合起來，以獲得足夠的數量進行分析。反之，這給并行樣本處理帶來了挑戰，必須確保將樣本損失降到最低，以避免時間、資源的浪費。

綜合處理這些問題的方法

斯拉沃夫實驗室的研究人員已經確定了幾種克服上述挑戰的方法。為了解決低樣品豐度的問題，設計了減少表面損失的措施，允許使用小體積樣品。細胞裂解方法的改變省去了在質譜分析之前的清理步驟，這是現有質譜方法中的一個關鍵步驟，通常會損失大量的蛋白質。多孔板的使用有助于確保分析是可靠和穩健的。最后，自動化的引入是消除人工樣本處理錯誤和增加通量的基礎。

SCoPE2工作流程

為了解MANTIS?液體處理器是如何運用于SCoPE2中，掌握SCoPE2工作流程是很重要的(圖2) 。下面展示的工作流總結，用橙色標出了使用MANTIS?液體處理器的階段。
 

SCoPE2 工作流程：

• 用1 μL含25 pmol Waters MassPREPTM（一種簡單的5肽混合物，有助于鈍化塑料制品）的純水制備384-孔板。

• 使用細胞分揀器將單個細胞分配到孔板中，以實現隨機布局(圖3)，并在-80°C冷凍孔板。

• 將孔板快速轉到PCR機上，并在90°C加熱10分鐘溶解細胞。

• 慢速旋轉孔板，冷卻，在水浴聲納器孵育5分鐘，然后再次旋轉。

• 每孔加入0.2 μL主混合液（00mM TEAB, 10ng /μL胰蛋白酶，0.25單位/μL苯并酮酶），將蛋白分解為多肽，37℃孵化3小時。

• 每孔加入0.5 μL 22 mM TMT（100%乙腈）標記多肽，室溫孵化1小時。

• 每孔加入0.2μL0.5％羥胺，淬滅任何未反應的TMT，室溫孵化30分鐘。

• 使用多道移液管組合樣品，轉移到自動進樣器玻璃插入瓶中，集中干燥。

• 樣品重新懸浮于1.2 μL 0.1%甲酸溶液中，用于LC-MS/MS分析。

圖2：SSsc工作流。使用MANTIS?液體處理器進行的步驟以橙色顯示。

 

使用MANTIS?液體處理器提高了定量準確性

通過在原有的SCoPE-MS工作流程中引入自動化、小型化的樣品制備，斯拉沃夫實驗室的研究人員獲益于顯著增加的實驗通量。使用SCoPE2，可在短短10天的儀器運行時間內量化1018個單個單核細胞和巨噬細胞中超過2700個蛋白質，量化的蛋白質允許通過細胞類型識別單個細胞。

MANTIS?液體處理器是為SCoPE2工作流程四個關鍵步驟提供可靠的亞微升分配的重要組成部分，即為細胞分選板的準備、蛋白質分解、肽標記和TMT反應的猝滅。MANTIS?液體處理器的幾個重要特性使SCoPE2選擇了它，首先是它的單噴嘴結構和非接觸式分配能力。由于每個孔包含不同的細胞類型（圖3），必須避免交叉污染。

圖3:在MANTIS?液體處理器上分配的隨機布局示例：綠色-載體，藍色-細胞1型，紅色-細胞2型，黑色-控制（無細胞）。

MANTIS?液體處理器的理想特性是它與各種試劑的兼容性。雖然分配水溶液對大多數液體處理平臺沒有什么問題，但準確分配亞微升體積的困難液體，如100%乙腈（用于存儲和稀釋 TMT標簽）是具有相當挑戰性的。最后，通過高度直觀的軟件，可以方便且快捷地集成到現有的工作流程中，MANTIS?液體處理器使斯拉沃夫實驗室的研究人員能夠繼續開發SCoPE2，不會因為儀器設置造成延誤。