活性氧（ROS）在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著極為重要的角色，涉及到細(xì)胞的衰老、死亡、癌變。對(duì)ROS的檢測(cè)是許多課題中的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)之一。 H2DCFDA（DCFH-DA，AbMoel，M9096）是一款靈敏的ROS探針，為科研工作者提供了重要的研究工具。 AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、靶點(diǎn)蛋白、化合物庫(kù)、抗生素等科研試劑，全球大量文獻(xiàn)專利引用。   一、H2DCFDA（DCFH-DA）的機(jī)理 H2DCFDA（2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯，AbMole，M9096）是一種常用的活性氧（ROS）熒光探針，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研究。H2DCFDA是一種細(xì)胞滲透性指示劑，在細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用下，其乙酸基團(tuán)被去除，產(chǎn)物為H2DCF。此時(shí)處于非熒光狀態(tài)，并且無(wú)法再通過(guò)細(xì)胞膜。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在氧化環(huán)境時(shí)，H2DCF會(huì)被氧化為發(fā)綠色熒光的2,7-二氯二氫熒光素（DCF，EX/EM = 488/525 nm），從而可用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。 圖 1. H2DCFDA檢測(cè)ROS的原理   二、H2DCFDA（DCFH-DA）的研究應(yīng)用 H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）作為一種細(xì)胞滲透性探針，能夠有效檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和ROS水平。H?DCFDA可以檢測(cè)過(guò)氧化氫（H?O?）、超氧陰離子（O2?）、羥基自由基（·OH）和過(guò)氧亞硝酸鹽（ONOO?）等ROS。一般可將細(xì)胞與H2DCFDA（多數(shù)情況下濃度為10 μM）孵育30分鐘，然后用流式細(xì)胞術(shù)或者熒光顯微鏡進(jìn)檢測(cè)。注意染色過(guò)程中要使用無(wú)血清的培養(yǎng)基，以免影響檢測(cè)結(jié)果。   近年來(lái)，鐵死亡（Ferroptosis）研究取得了顯著進(jìn)展，H?DCFDA作為檢測(cè)工具在其中發(fā)揮了重要作用。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，并結(jié)合 ABDP 581/591 C11（AbMoel，M29325）進(jìn)行脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)，以及 CCK-8（AbMole，M4839）等進(jìn)行細(xì)胞活力分析，可以分析細(xì)胞死亡的主要原因和類型。 2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國(guó)家心血管研究中心和美國(guó)哥倫比亞大學(xué)用于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。   三、范例詳解 1. Sci Adv. 2024 Aug 16;10(33):eado7249.  蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的研究人員設(shè)計(jì)了一種水凝膠（FDA-TA），它可通過(guò)重塑鐵代謝來(lái)修復(fù)組織。FDA-TA可以吸附胞外的鐵離子，以調(diào)節(jié)鐵代謝并抑制鐵死亡，進(jìn)而促進(jìn)組織修復(fù)。研究者構(gòu)建了大鼠尾椎穿刺模型，來(lái)評(píng)估FDA-TA對(duì)椎間盤(pán)退行性病變（IVDD）的抑制效果。實(shí)驗(yàn)人員在探究鐵離子（Fe3+）能否引起細(xì)胞氧化應(yīng)激和鐵死亡的實(shí)驗(yàn)中，使用了AbMole的 H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）和 JC-1 （AbMole，M9724），它們分別被用于檢測(cè)活性氧（ROS）的生成和線粒體膜電位的變化[1]。
  圖 2. Fe3+可以誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體膜電位異常[1]   2. Plant Biotechnol J. 2023 May;21(5):943-960.  蘭州大學(xué)、寧夏醫(yī)科大學(xué)的研究者們?cè)谏鲜稣撐闹醒芯苛薈2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子OSIC1在楊樹(shù)中對(duì)滲透脅迫下氣孔關(guān)閉的正向調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，OSIC1在鹽、干旱、 聚乙二醇6000（PEG6000）和 脫落酸（M7597，ABA）誘導(dǎo)下表達(dá)上調(diào)。過(guò)表達(dá)OSIC1的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)在上述處理?xiàng)l件下表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性，這主要是通過(guò)減少氣孔開(kāi)度來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生的OSIC1突變體則表現(xiàn)出相反的表型。此外，OSIC1能夠直接上調(diào)PalCuAOζ的表達(dá)，該基因編碼一種含銅多胺氧化酶，可增強(qiáng)保衛(wèi)細(xì)胞（ guard cells，負(fù)責(zé)儲(chǔ)存淀粉調(diào)節(jié)滲透壓的細(xì)胞）的過(guò)氧化氫積累，從而在環(huán)境壓力發(fā)生時(shí)調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉。在這項(xiàng)研究中，AbMole的 H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用來(lái)檢測(cè)楊樹(shù)保衛(wèi)細(xì)胞在不同處理?xiàng)l件下的H?O?積累情況[2]。
  圖 3. Detection of H2O2 in guard cells under different treatments[2].   3. Mater Today Bio. 2023 Jun 24;21:100711.  蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的研究者們?cè)谏鲜鑫恼轮醒邪l(fā)了一種以黑色素為原型的微囊（BHB-PDA-MCs），用于肝纖維化（HF）的抑制。BHB-PDA-MCs的核心為水相，外殼由聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）和聚多巴胺納米顆粒（PDANPs）組成。PDANPs是天然黑色素的合成類似物，具有抗氧化特性。而微囊的核心用于封裝酮體β-羥基丁酸（BHB），這是一種已知的免疫代謝調(diào)節(jié)劑，能夠抑制NLRP3炎癥體的激活。在體外實(shí)驗(yàn)中，PDANPs能夠減輕H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞（LO2細(xì)胞）和肝星狀細(xì)胞（HSC-T6細(xì)胞）的氧化水平，而B(niǎo)HB能夠減少巨噬細(xì)胞（Raw264.7細(xì)胞）產(chǎn)生的促炎和促纖維化因子；在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中，研究者發(fā)現(xiàn)BHB-PDA-MCs能夠抑制HSCs的激活，減少ECM蛋白的沉積，減輕肝小葉的損傷，并保護(hù)肝功能。在這項(xiàng)研究中，AbMole的 H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用來(lái)檢測(cè)LO2和HSC-T6細(xì)胞在H2O2刺激下的氧化水平和微囊系統(tǒng)的保護(hù)作用。
  圖 4. Fluorescent images showing the ROS levels in LO2 or HSC-T6 cells after co-cultured with blank control, H2O2, or PDA-MCs[3]   AbMole是ChemBridge中國(guó)區(qū)官方指定合作伙伴。     參考文獻(xiàn)及鳴謝 [1] Y. Xu, F. CAI, Y. Zhou, et al., Magnetically attracting hydrogel reshapes iron metabolism for tissue repair, Science advances 10(33) (2024) eado7249. [2] Q. Bai, Z. Niu, Q. Chen, et al., The C(2) H(2) -type zinc finger transcription factor OSIC1 positively regulates stomatal closure under osmotic stress in poplar, Plant biotechnology journal 21(5) (2023) 943-960. [3] X. Zhao, Z. Fan, C. Zhu, et al., Melanin insPIred microcapsules delivering immune metabolites for hepatic fibrosis management, Materials today. Bio 21 (2023) 100711.