CD244基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建及單克隆抗體制備研究_abio生物試劑品牌網(wǎng)
摘要
通過(guò)構(gòu)建CD244基因轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞株，并基于此制備特異性單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)采用電穿孔儀（威尼德）完成基因轉(zhuǎn)染，篩選獲得高表達(dá)細(xì)胞株；通過(guò)免疫動(dòng)物及雜交瘤技術(shù)獲得抗體，經(jīng)ELISA、Western blot驗(yàn)證其特異性。研究為CD244功能研究及靶向治療提供了可靠工具，實(shí)驗(yàn)流程具有可重復(fù)性。
引言
CD244基因編碼的蛋白屬于信號(hào)淋巴細(xì)胞活化分子家族（SLAM），在免疫調(diào)節(jié)及腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。近年研究表明，CD244在多種癌癥中異常表達(dá)，但其具體作用機(jī)制尚不明確。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD244的細(xì)胞株及高特異性抗體，是解析其生物學(xué)功能的關(guān)鍵。現(xiàn)有研究多采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或商業(yè)化抗體，存在表達(dá)不穩(wěn)定或交叉反應(yīng)等問(wèn)題。為此，本研究旨在通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建CD244過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，并基于此開發(fā)高親和力單克隆抗體，為后續(xù)機(jī)制探索及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1. 實(shí)驗(yàn)部分
材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
細(xì)胞與質(zhì)粒：人胚腎HEK293T細(xì)胞，CD244基因全長(zhǎng)克隆至pCDNA3.1載體（某試劑）。
儀器：電穿孔儀、紫外交聯(lián)儀、分子雜交儀（均為威尼德）；流式細(xì)胞儀（某品牌）。
試劑：Lipofectamine 3000（某試劑）、G418篩選培養(yǎng)基（某試劑）、弗氏佐劑（某試劑）。
1.2 CD244穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建
1.2.1 質(zhì)粒擴(kuò)增與純化
將CD244-pCDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)LB培養(yǎng)基擴(kuò)增后，使用某試劑盒純化質(zhì)粒，測(cè)定濃度及純度（A260/A280>1.8）。
1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選
HEK293T細(xì)胞以電穿孔儀（威尼德）轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整密度至1×10^6/mL，與20 μg質(zhì)粒混合后，參數(shù)設(shè)為電壓250 V、脈沖時(shí)間10 ms。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，加入含800 μg/mL G418（某試劑）的培養(yǎng)基篩選14天，每3天更換培養(yǎng)基。通過(guò)有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株。
1.2.3 表達(dá)驗(yàn)證
流式細(xì)胞術(shù)：細(xì)胞經(jīng)抗CD244一抗（某試劑）及FITC標(biāo)記二抗（某試劑）染色，流式細(xì)胞儀（某品牌）檢測(cè)陽(yáng)性率。
Western blot：裂解細(xì)胞后取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜后以CD244抗體（某試劑）及HRP標(biāo)記二抗（某試劑）顯影。
1.3 單克隆抗體制備
1.3.1 動(dòng)物免疫
選取6周齡BALB/c小鼠，以CD244過(guò)表達(dá)細(xì)胞裂解液（100 μg/次）與弗氏佐劑（某試劑）乳化后皮下注射，間隔2周加強(qiáng)免疫3次。末次免疫7天后取脾細(xì)胞。
1.3.2 細(xì)胞融合與篩選
脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以5:1比例混合，采用PEG（某試劑）誘導(dǎo)融合。融合后細(xì)胞接種于HAT培養(yǎng)基（某試劑），37℃、5% CO2培養(yǎng)10天。通過(guò)ELISA篩選上清液陽(yáng)性孔：包被CD244重組蛋白（某試劑），加入雜交瘤上清，HRP標(biāo)記二抗（某試劑）顯色，OD450>0.5判定為陽(yáng)性。
1.3.3 亞克隆與抗體純化
陽(yáng)性孔細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法亞克隆3次，獲得穩(wěn)定分泌抗體的單克隆株。擴(kuò)大培養(yǎng)后收集上清，經(jīng)Protein A親和層析（某試劑）純化抗體，BCA法測(cè)定濃度。
1.4 抗體特性分析
親和力檢測(cè)：采用表面等離子共振（SPR，某品牌）分析抗體與CD244結(jié)合動(dòng)力學(xué)。
特異性驗(yàn)證：Western blot檢測(cè)抗體對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及陰性對(duì)照細(xì)胞的反應(yīng)性；免疫組化分析組織切片中CD244表達(dá)定位。
2. 結(jié)果與討論
2.1 CD244穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建
經(jīng)G418篩選及流式分選，獲得3株CD244高表達(dá)HEK293T細(xì)胞（陽(yáng)性率>95%）。Western blot顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CD244蛋白條帶清晰，分子量約70 kDa，與預(yù)期一致。
2.2 單克隆抗體制備
ELISA初篩獲得12孔陽(yáng)性雜交瘤，經(jīng)亞克隆后最終獲得2株穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株（分別命名為mAb-3F2、mAb-5D8）。SPR檢測(cè)顯示mAb-3F2親和力KD值為1.2×10^-9 M，優(yōu)于已報(bào)道的同類抗體。Western blot證實(shí)兩者僅與CD244過(guò)表達(dá)細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。
2.3 應(yīng)用潛力分析
研究構(gòu)建的細(xì)胞株為CD244信號(hào)通路研究提供了穩(wěn)定模型；所獲單克隆抗體在流式分選、免疫組化中均表現(xiàn)優(yōu)異，未來(lái)可進(jìn)一步用于腫瘤免疫治療靶點(diǎn)驗(yàn)證。
結(jié)論
研究成功構(gòu)建CD244穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，并制備出高特異性單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)（威尼德）及篩選策略，顯著提升轉(zhuǎn)染效率與抗體親和力。研究成果為CD244相關(guān)疾病機(jī)制研究及診斷試劑開發(fā)提供了重要工具。
參考文獻(xiàn)
1. Yamagami T,Fuji S,Tamaki H,等.CD48 as a novel molecular target for antibody therapy in multiple myeloma.[J].British Journal of Haematology.2012,156(2).
2. Kim N. Aldy,Nathan C. Horton,Porunelloor A. Mathew,等.2B4+ CD8+ T cells play an inhibitory role agAInst constrained HIV ePItopes[J].Biochemical & Biophysical Research Communications.2011,405(3).503-507.
3. Upshaw Neff JL,Dick CJ,Chini CC,等.2B4 utilizes ITAM-containing receptor complexes to initiate intracellular signaling and cytolysis.[J].Molecular Immunology.2011,48(9).
4. Terhorst C,Calpe S,Sharpe AH,等.Cutting edge: an NK cell-independent role for slamf4 in controlling humoral autoimmunity.[J].The Journal of Immunology: Official Journal of the American Association of Immunologists.2011,187(1).
5. Levi Schaffer F,Elishmereni M.CD48: A co-stimulatory receptor of immunity.[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology.2011,43(1).
[6]Tarazona R,Delgado E,Guarnizo MC,等.Human prostasomes express CD48 and interfere with NK cell function.[J].Immunobiology: Zeitschrift fur Immunitatsforschung.2011,216(1/2).41-46.DOI:10.1016/j.imbio.2010.03.002 .
7. Kim K,Kumar V,Lee KM,等.Unidirectional signaling triggered through 2B4 (CD244), not CD48, in murine NK cells.[J].Journal of Leukocyte Biology: An Official Publication of the Reticuloendothelial Society.2010,88(4).
通過(guò)構(gòu)建CD244基因轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞株，并基于此制備特異性單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)采用電穿孔儀（威尼德）完成基因轉(zhuǎn)染，篩選獲得高表達(dá)細(xì)胞株；通過(guò)免疫動(dòng)物及雜交瘤技術(shù)獲得抗體，經(jīng)ELISA、Western blot驗(yàn)證其特異性。研究為CD244功能研究及靶向治療提供了可靠工具，實(shí)驗(yàn)流程具有可重復(fù)性。
引言
CD244基因編碼的蛋白屬于信號(hào)淋巴細(xì)胞活化分子家族（SLAM），在免疫調(diào)節(jié)及腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。近年研究表明，CD244在多種癌癥中異常表達(dá)，但其具體作用機(jī)制尚不明確。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD244的細(xì)胞株及高特異性抗體，是解析其生物學(xué)功能的關(guān)鍵。現(xiàn)有研究多采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或商業(yè)化抗體，存在表達(dá)不穩(wěn)定或交叉反應(yīng)等問(wèn)題。為此，本研究旨在通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建CD244過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，并基于此開發(fā)高親和力單克隆抗體，為后續(xù)機(jī)制探索及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1. 實(shí)驗(yàn)部分
材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
細(xì)胞與質(zhì)粒：人胚腎HEK293T細(xì)胞，CD244基因全長(zhǎng)克隆至pCDNA3.1載體（某試劑）。
儀器：電穿孔儀、紫外交聯(lián)儀、分子雜交儀（均為威尼德）；流式細(xì)胞儀（某品牌）。
試劑：Lipofectamine 3000（某試劑）、G418篩選培養(yǎng)基（某試劑）、弗氏佐劑（某試劑）。
1.2 CD244穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建
1.2.1 質(zhì)粒擴(kuò)增與純化
將CD244-pCDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)LB培養(yǎng)基擴(kuò)增后，使用某試劑盒純化質(zhì)粒，測(cè)定濃度及純度（A260/A280>1.8）。
1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選
HEK293T細(xì)胞以電穿孔儀（威尼德）轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整密度至1×10^6/mL，與20 μg質(zhì)粒混合后，參數(shù)設(shè)為電壓250 V、脈沖時(shí)間10 ms。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，加入含800 μg/mL G418（某試劑）的培養(yǎng)基篩選14天，每3天更換培養(yǎng)基。通過(guò)有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株。
1.2.3 表達(dá)驗(yàn)證
流式細(xì)胞術(shù)：細(xì)胞經(jīng)抗CD244一抗（某試劑）及FITC標(biāo)記二抗（某試劑）染色，流式細(xì)胞儀（某品牌）檢測(cè)陽(yáng)性率。
Western blot：裂解細(xì)胞后取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜后以CD244抗體（某試劑）及HRP標(biāo)記二抗（某試劑）顯影。
1.3 單克隆抗體制備
1.3.1 動(dòng)物免疫
選取6周齡BALB/c小鼠，以CD244過(guò)表達(dá)細(xì)胞裂解液（100 μg/次）與弗氏佐劑（某試劑）乳化后皮下注射，間隔2周加強(qiáng)免疫3次。末次免疫7天后取脾細(xì)胞。
1.3.2 細(xì)胞融合與篩選
脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以5:1比例混合，采用PEG（某試劑）誘導(dǎo)融合。融合后細(xì)胞接種于HAT培養(yǎng)基（某試劑），37℃、5% CO2培養(yǎng)10天。通過(guò)ELISA篩選上清液陽(yáng)性孔：包被CD244重組蛋白（某試劑），加入雜交瘤上清，HRP標(biāo)記二抗（某試劑）顯色，OD450>0.5判定為陽(yáng)性。
1.3.3 亞克隆與抗體純化
陽(yáng)性孔細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法亞克隆3次，獲得穩(wěn)定分泌抗體的單克隆株。擴(kuò)大培養(yǎng)后收集上清，經(jīng)Protein A親和層析（某試劑）純化抗體，BCA法測(cè)定濃度。
1.4 抗體特性分析
親和力檢測(cè)：采用表面等離子共振（SPR，某品牌）分析抗體與CD244結(jié)合動(dòng)力學(xué)。
特異性驗(yàn)證：Western blot檢測(cè)抗體對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及陰性對(duì)照細(xì)胞的反應(yīng)性；免疫組化分析組織切片中CD244表達(dá)定位。
2. 結(jié)果與討論
2.1 CD244穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建
經(jīng)G418篩選及流式分選，獲得3株CD244高表達(dá)HEK293T細(xì)胞（陽(yáng)性率>95%）。Western blot顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CD244蛋白條帶清晰，分子量約70 kDa，與預(yù)期一致。
2.2 單克隆抗體制備
ELISA初篩獲得12孔陽(yáng)性雜交瘤，經(jīng)亞克隆后最終獲得2株穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株（分別命名為mAb-3F2、mAb-5D8）。SPR檢測(cè)顯示mAb-3F2親和力KD值為1.2×10^-9 M，優(yōu)于已報(bào)道的同類抗體。Western blot證實(shí)兩者僅與CD244過(guò)表達(dá)細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。
2.3 應(yīng)用潛力分析
研究構(gòu)建的細(xì)胞株為CD244信號(hào)通路研究提供了穩(wěn)定模型；所獲單克隆抗體在流式分選、免疫組化中均表現(xiàn)優(yōu)異，未來(lái)可進(jìn)一步用于腫瘤免疫治療靶點(diǎn)驗(yàn)證。
結(jié)論
研究成功構(gòu)建CD244穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，并制備出高特異性單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)（威尼德）及篩選策略，顯著提升轉(zhuǎn)染效率與抗體親和力。研究成果為CD244相關(guān)疾病機(jī)制研究及診斷試劑開發(fā)提供了重要工具。
參考文獻(xiàn)
1. Yamagami T,Fuji S,Tamaki H,等.CD48 as a novel molecular target for antibody therapy in multiple myeloma.[J].British Journal of Haematology.2012,156(2).
2. Kim N. Aldy,Nathan C. Horton,Porunelloor A. Mathew,等.2B4+ CD8+ T cells play an inhibitory role agAInst constrained HIV ePItopes[J].Biochemical & Biophysical Research Communications.2011,405(3).503-507.
3. Upshaw Neff JL,Dick CJ,Chini CC,等.2B4 utilizes ITAM-containing receptor complexes to initiate intracellular signaling and cytolysis.[J].Molecular Immunology.2011,48(9).
4. Terhorst C,Calpe S,Sharpe AH,等.Cutting edge: an NK cell-independent role for slamf4 in controlling humoral autoimmunity.[J].The Journal of Immunology: Official Journal of the American Association of Immunologists.2011,187(1).
5. Levi Schaffer F,Elishmereni M.CD48: A co-stimulatory receptor of immunity.[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology.2011,43(1).
[6]Tarazona R,Delgado E,Guarnizo MC,等.Human prostasomes express CD48 and interfere with NK cell function.[J].Immunobiology: Zeitschrift fur Immunitatsforschung.2011,216(1/2).41-46.DOI:10.1016/j.imbio.2010.03.002 .
7. Kim K,Kumar V,Lee KM,等.Unidirectional signaling triggered through 2B4 (CD244), not CD48, in murine NK cells.[J].Journal of Leukocyte Biology: An Official Publication of the Reticuloendothelial Society.2010,88(4).
