豬傳染性胃腸炎病毒熒光PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）?
使用說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：豬傳染性胃腸炎病毒熒光PCR檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Transmissible gastroenteritis virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】
本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測豬傳染性胃腸炎病毒，對豬傳染性胃腸炎病毒引起的疾病診斷及療效評估有重要指導意義。

【原     理】
本試劑盒針對豬傳染性胃腸炎病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，在反應體系中含豬傳染性胃腸炎病毒基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量pcr儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【 試劑盒 組成】

序號	組成	50T/盒
1	TGEV RT-PCR反應液	875 μL×1管
2	TGEV混合酶液	125 μL×1管
3	TGEV陽性對照	40 μL×1管
4	TGEV陰性對照	40 μL×1管
5	說明書	1份

  注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含豬傳染性胃腸炎靶基因的質(zhì)粒。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】
1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2.分泌物：用拭子沾取分泌液后放入有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用。
3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中，3000 rpm 離心10分鐘取上清待檢。
4.應避免標本間交叉污染。
5.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。

【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)	RT-PCR反應液	17.5μL
	混合酶液	2.5 μL

  （3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

反應體積	25 μL	通道選擇	FAM通道采集  TGEV 熒光信號
PCR 反應 條件	步驟	條件	循環(huán)數(shù)
	反轉(zhuǎn)錄	50℃：10分鐘（min）	1
	預變性	95℃：3分鐘（min）	1
	PCR擴增	95℃：5秒（s）	40
		55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號）

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標本結(jié)果判定：
（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果	標本檢測結(jié)果解釋
FAM
+	標本中檢出豬傳染性胃腸炎病毒
-	標本中未檢出豬傳染性胃腸炎病毒

  【檢驗方法的局限性】

• 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
• 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
• 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最低檢出限為10 ³CoPIes/mL，產(chǎn)品CV值≤3%。

【注意事項】

• 使用本試劑盒的實驗室，應嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；
• 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理；
• 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結(jié)束后，應立即對工作臺清潔；
• 吸取反應液時，應盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確；
• 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心；
• 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放；
• 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記；
• 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；
• 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。