CAR-T療法自2012年首次成功應用以來，已為數萬名患者提供了治療機會，其中大部分患者實現了臨床獲益，有的患者能夠長期生存甚至臨床治愈。CAR-T療法顯著改善了血液惡性腫瘤患者的生存質量，并在實體瘤領域展現了強勁的治療潛力。但傳統的CAR-T療法存在生產方法復雜、生產成本高昂以及細胞因子釋放綜合征和致瘤性等風險，這些因素嚴重阻礙了CAR-T療法惠及更廣泛的患者群。

mRNA是一種可以在細胞中快速表達功能性蛋白而無需基因整合的潛在治療制劑，但目前的mRNA遞送載體（如脂質納米顆粒）存在T細胞攝取能力差和內體逃逸效率低的問題。因此，迫切需要開發一種能夠在體內特異性和高效地將mRNA遞送到T細胞中的新型遞送載體。

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）是一種由包膜、衣殼和RNA組成的RNA病毒，能夠特異性感染人類CD4+T細胞。HIV的包膜糖蛋白gp160能夠識別T細胞上的CD4分子，從而促進病毒包膜與T細胞膜的融合，使得由衣殼蛋白裝載的基因組RNA能夠被直接遞送至T細胞的細胞質中，從而繞過了內吞途徑。此外，有研究表明，一種突變的gp160能夠靶向CD4+和CD8+T細胞，擴展了對不同T細胞亞群的靶向潛力。因此，HIV作為一種具有獨特遞送方式的天然的RNA藥物載體，通過細胞靶向膜融合機制，能夠特異且高效地將RNA遞送至T細胞中。

2025年3月11日，華南理工大學王均教授和許從飛副教授團隊在Cell Biomaterials上發表了題為“Leveraging T cell-specific fusogenicity of HIV for in vivo mRNA delivery to produce human CAR-T cells”的研究論文。該研究通過模擬HIV的膜融合機制，開發了一種T細胞特異性膜融合病毒樣顆粒（T-FVLPmCAR），能夠高效地將CAR mRNA遞送到T細胞中，在體內直接生成CAR-T細胞。小鼠模型實驗顯示，T-FVLPmCAR能夠在體內生成足夠的CAR-T細胞并有效治療B細胞淋巴瘤，且不會引發細胞因子釋放綜合征及神經毒性等副作用，從而為CAR-T療法提供了一種可擴展的、更安全的替代方案。

一、T-FVLP的設計與表征
為了開發一種能夠特異性與T細胞膜融合的病毒樣顆粒（T-FVLP），研究者對293TB2M－/－細胞和編碼突變型gp160包膜糖蛋白及Peg10衣殼蛋白的質粒共轉染，成功制備了T-FVLP。透射電子顯微鏡圖像顯示，T-FVLP為直徑97.2 nm的球形顆粒，具有良好的單分散性（圖1B, C）。通過納米流式檢測儀（Flow NanoAnalyzer）測定T-FVLP的顆粒數量，結果表明每1×107個293TB2M－/－細胞可以產生1.5×109個T-FVLP顆粒。Western blot分析進一步確認了T-FVLP具有突變型gp160和Peg10蛋白成分（圖1D）。為了驗證T-FVLP與T細胞膜的融合能力，研究者將標記了DiD染料的T-FVLP與人類外周血單個核細胞（PBMCs）共孵育，經流式細胞術分析發現，T-FVLP能夠特異性地與T細胞膜融合，使34.6%的CD3＋T細胞表現出DiD的陽性信號，顯著高于野生型gp160組成的VLP對照組（2.7%）（圖1E-K）。此外，如果在T-FVLP與T細胞孵育時加入gp160抑制劑enfuvirtide，融合效率顯著降低，證實了突變型gp160在T-FVLP與T細胞膜融合中的關鍵作用（圖1L, M）。上述結果表明，本研究成功構建了能夠特異性地與CD4+和CD8+T細胞膜融合的T-FVLP，為后續的CAR mRNA遞送和CAR-T細胞生成提供了高效的載體。

圖1. T-FVLP的構建與表征

二、體外驗證T-FVLPmCAR的遞送效率
通過將293TB2M－/－細胞與編碼突變型gp160包膜糖蛋白、Peg10衣殼蛋白和αhCD19 mRNA共轉染制備T-FVLPmCAR。研究者隨后利用納米流式檢測儀在單顆粒水平檢測CAR mRNA的裝載效率。結果顯示，幾乎所有T-FVLPmCAR顆粒都裝載了CAR mRNA（圖2B），每個顆粒可裝載高達9.5 ng的CAR mRNA。這表明T-FVLPmCAR具有高效裝載mRNA的能力。

隨后，研究者將T-FVLPmCAR與T細胞共孵育，結果顯示，25.6%的CD3＋T細胞成功表達了CAR蛋白（圖2C），這表明T-FVLPmCAR能夠將CAR mRNA高效地遞送到T細胞中，并在細胞內成功翻譯為功能性CAR蛋白。進一步的功能驗證顯示，這些CAR-T細胞對CD19＋腫瘤細胞具有顯著的特異性殺傷能力（圖2H-K）。此外，CAR-T細胞的生成具有瞬時性，CAR表達在48小時后顯著下降（圖2F-J）。這種瞬時性有助于降低細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome, CRS）的風險。

綜上所述，T-FVLPmCAR能夠在體外高效地將CAR mRNA遞送到T細胞中，并生成具有抗原特異性細胞毒性的CAR-T細胞。

圖2. T-FVLPmCAR通過T細胞特異性膜融合產生αhCD19 CAR-T細胞

三、體內原位生成CAR-T細胞
為了進一步驗證T-FVLPmCAR是否能夠在體內將CAR mRNA高效地遞送到T細胞中，并在體內原位生成CAR-T細胞。研究者通過尾靜脈注射DiD標記的T-FVLP和T-FVLPmCAR到免疫人源化NCG小鼠體內，流式細胞術結果顯示，T-FVLP能夠特異性地與循環T細胞發生膜融合，使5.5%的CD3＋T細胞表現出DiD陽性信號，而B細胞和髓系細胞中幾乎未檢測到融合信號（圖3A-F），這表明T-FVLP在體內具有高度的T細胞靶向性。進一步實驗表明，T-FVLPmCAR能夠將3.2%的循環T細胞轉化為αhCD19 CAR-T細胞，且在非T細胞中未檢測到CAR表達（圖3G-L），證實了T-FVLPmCAR在體內生成CAR-T細胞的特異性和高效性。

圖3. 通過T-FVLPmCAR在體內構建αhCD19 CAR-T細胞

四、腫瘤治療療效和安全性
在免疫人源化NCG小鼠模型中，研究者評估了T-FVLPmCAR對Raji-Luc B細胞淋巴瘤的治療效果和安全性。小鼠被植入Raji-Luc B細胞淋巴瘤后接受T-FVLPmCAR治療。結果顯示，T-FVLPmCAR顯著抑制了腫瘤生長，腫瘤抑制率高達83.5%~99.0%，且在高劑量下部分小鼠實現了腫瘤完全消退（圖4B-E）。

在安全性方面，治療后小鼠血清中炎癥細胞因子水平未顯著升高，體重無明顯變化，表明治療未引起明顯的全身性炎癥反應或對小鼠整體健康產生負面影響。此外，通過組織病理學分析，研究者未在小鼠的主要器官（如心、肝、肺、腎和腦）中發現明顯的組織損傷或神經毒性（圖4F-L），這些結果表明，T-FVLPmCAR不僅在治療B細胞淋巴瘤方面表現出顯著的療效，還具有良好的生物相容性和安全性。

圖4. T-FVLPmCAR治療B細胞淋巴瘤且不引發明顯副作用

總結
本研究巧妙地模擬HIV的膜融合機制，成功開發出T-FVLPmCAR——一種能精準向T細胞遞送CAR mRNA的創新載體。這種策略不僅提升了CAR mRNA的遞送效率，在體內高效生成CAR-T細胞，并有效地抑制了B細胞淋巴瘤的生長，同時避免了傳統CAR-T療法的常見副作用。該成果為CAR-T療法開辟了一種更安全、高效的體內生產方法，有很大希望可拓展其臨床應用范圍，為癌癥治療帶來新的曙光。

展望
納米流式檢測儀（NanoFCM）不僅可以在單顆粒水平分析T-FVLPmCAR粒徑及其分布、顆粒濃度，同時可對VLP顆粒的常見的生化組分（核酸、包膜蛋白、結構蛋白等）進行單一組分鑒定和不同組分之間的共定位分析，實時優化工藝流程，提高產品的純度和成品率。這種一機多能的表征方案，不僅可助力CAR-T產業降本增效，更將在細胞與基因治療領域的病毒表征中大放異彩，為行業的發展添磚加瓦。