ChIP-seq等技術揭示突變在癌癥中的H3K36甲基化新型表觀遺傳治療靶點_abio生物試劑品牌網
SETD2（SET domAIn containing 2）是哺乳動物中唯一負責催化H3K36me3（histone 3,
lysine 36,tri-methylation）蛋白的表觀遺傳因子。H3K36me3在RNA剪接、DNA修復和轉錄起始調控等多種細胞過程中發揮重要作用，SETD2突變與多種癌癥的發生發展密切相關，尤其是在透明細胞腎細胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）中，SETD2突變與不良預后相關。然而，SETD2功能喪失型突變的靶向治療一直是一個挑戰。
近日，美國梅奧診所分子藥理學和實驗治療學系Keith D. Robertson團隊聯合美國南卡醫科大學 (MUSC) Hollings癌癥中心Thai H. Ho，合作探索了SETD2功能喪失型突變在癌癥中的作用機制，并尋找靶向這種突變的新型表觀遺傳靶向治療方法。研究通過一系列的實驗，包括基因組范圍內的合成致死（synthetic lethal, SL）篩選、基因編輯、表觀遺傳分析（ChIP-seq）和藥物驗證等，揭示了SETD2缺失細胞對NSD1（nuclear receptor-binding SET domain protein 1）介導的H3K36甲基化具有特有敏感性，并提出了基于表觀遺傳修飾的個性化治療策略。相關研究成果以《SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to ePIgenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation》為題發表于《Genome Biology》期刊。
標題：SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to epigenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation（SETD2功能喪失型突變使細胞對NSD1介導的H3K36甲基化的表觀遺傳靶向治療具有獨特敏感性）
期刊：Genome Biology
影響因子：IF10.1/Q1
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq等
本研究首先采用了一種無偏倚的全基因組范圍的合成致死篩選方法，鑒定出另一個H3K36me 的writer因子NSD1是SETD2突變細胞中的合成致死（SL）修飾因子，并在小鼠和人類的同源透明細胞腎細胞癌和永生化腎上皮細胞系中驗證了這種合成致死相互作用。通過CRISPRi靶向方法耗盡NSD1，會促進SETD2突變細胞丟失，同時伴隨DNA損傷和凋亡水平升高。但只有抑制NSD1（非其他相關H3K36甲基轉移酶）才會在這些模型中促進合成致死性。分別對NSD1和NSD2的基因組H3K36me2靶向進行作圖，揭示了這些表觀遺傳writer因子的特異性功能。此外研究還通過使用BT5（一種靶向NSD1的首創藥物抑制劑）重現這種合成致死表型進行概念驗證，表明了靶向這種合成致死相互作用的治療可行性。
本研究將全基因組篩選方法與最新的遺傳和藥理學建模方法相結合，揭示了一種全新的表觀遺傳方法，用于靶向癌癥中具有挑戰性的SETD2功能喪失突變進行個性化治療。
研究方法
合成致死篩選：研究者利用CRISPR/Cas9技術在SETD2野生型和突變型的HAP1細胞系中進行基因組范圍的篩選，尋找與SETD2缺失具有合成致死關系的基因。
基因編輯和細胞模型構建：通過CRISPR/Cas9技術，研究者在多種細胞系中構建了SETD2野生型和突變型的同源細胞模型，包括ccRCC細胞系786-O和A498，以及小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）。
表觀遺傳分析：研究者利用ChIP-seq（染色質免疫沉淀測序）技術分析了H3K36me2和H3K36me3在基因組上的分布情況，以了解SETD2缺失對組蛋白修飾的影響。
藥物驗證：研究者使用BT5（一種針對NSD1的小分子抑制劑）驗證了通過藥物抑制NSD1是否能夠模擬基因敲除NSD1的合成致死效應。
結果圖形
（1）CRISPR/Cas9篩選揭示NSD1是SETD2突變人和小鼠細胞中的合成致死（SL）修飾因子
通過CRISPR/Cas9篩選，研究者發現NSD1是SETD2缺失細胞的合成致死修飾因子。在SETD2突變的細胞中，NSD1缺失會導致細胞活力顯著下降，伴隨DNA損傷和凋亡水平升高。
圖1：全基因組篩選鑒定NSD1為SETD2缺失細胞中的潛在SL修飾因子。
A. 對同源SETD2野生型/突變型HAP1細胞中整體H3K36甲基化狀態的Western blot分析。
B. CRISPR/Cas9合成致死篩選的示意圖。
C. 火山圖突出顯示NSD1為合成致死靶點。
D. 對篩選出的127個SL候選基因進行GO分析，發現在參與表觀遺傳重塑和DNA損傷/修復因子中富集。
E. 基因視圖示意圖，展示通過Cre-lox切除第6外顯子實現MEFs中Setd2的誘導性缺失。
F. PCR基因分型確認在Setd2flox/flox親本和Setd2flox/flox；Nsd1-/- MEF細胞系中他莫昔芬（tamoxifen）誘導的Cre活性。
G. Setd2flox/flox和Setd2flox/flox；Nsd1-/- MEF細胞系經4-OHT處理后結晶紫染色。
（2）通過基因組編輯驗證新型SETD2同源/缺失ccRCC模型
SETD2功能缺失突變在多種不同的癌癥類型中很常見，但在ccRCC中最常見，其中SETD2缺失促進腫瘤進展和轉移。因此研究人員選擇ccRCC細胞系786O和A498作為模型，以進一步探究NSD1在驅動SETD2突變體SL中的作用。
圖2：同源SETD2突變的失活/激活功能模型在透明細胞腎細胞癌（ccRCC）中的應用
A. 基因組示意圖突出顯示A498細胞系中SETD2的內源性突變以及用于通過同源重組（HR）修復2個核苷酸缺失的基因組編輯策略。
B. 在HR和Cre介導的選擇載體（selection cassette）切除后，對“修復”的A498（SET-HDR）細胞系進行PCR基因分型。
C. 通過Sanger測序色譜圖確認A498 SET-HDR細胞系中“TG”缺失的修復。
D. 在4×放大倍數下，對A498親本和SET-HDR細胞系進行明場形態學評估。
E. 對源自A498和786-O ccRCC細胞系的SETD2功能正常/缺失細胞系進行整體H3K36甲基化狀態的Western blot分析。
F. 通過ChIP-seq揭示的A498 SET-HDR和FLAG-SETD2拯救系中H3K36me3增加的火山圖。
G. A498親本、SET-HDR和FLAG-SETD2系中H3K36me3峰的標簽密度圖。
H. 對應于A498和786O ccRCC細胞系的野生型、SETD2突變和拯救細胞系中H3K36me3 peaks的基因水平視圖。
（3）轉錄組學/表觀基因組分析揭示H3K36me2在SETD2突變細胞中的潛在補償作用
表觀基因組（ChIP-seq）和轉錄組（RNA-seq）揭示SETD2缺失導致H3K36me3整體性丟失，而H3K36me2在基因組上的分布發生了顯著變化，特別是在SETD2缺失的細胞中，H3K36me2增加可能作為一種補償機制來維持基因組的穩定性。
圖3：SETD2/H3K36me3丟失導致的表觀遺傳重組增加了H3K36me2標記的普遍性
A-C. MA圖展示A498、786O和RPTEC同源模型中SETD2突變的差異基因表達。
D. A498、786O、RPTEC同源模型中SETD2突變及一組TCGA-KIRC的SETD2野生型/突變樣本的差異基因表達GSEA通路熱圖。
E. ccRCC模型中與干擾素信號和PD-1信號相關的SETD2依賴性調控的重疊GSEA富集圖。
F.在FLAG-SETD2拯救后，786-O突變細胞與野生型細胞（x軸）中差異表達基因逆轉（y軸）相關性圖。紅點表示在A498同源模型中觀察到的共有差異表達。
G. SETD2突變同源模型H3K36me3丟失peaks(黑色)和H3K36me2增加peaks(金色)火山圖。
H. A498和786O同源ccRCC中基因水平的H3K36me3(黑色)和H3K36me2(金色)peaks視圖。
(4) ccRCC細胞系通過CRISPRi抑制NSD1（而非NSD2或NSD3）能夠重現SETD2突變的SL表型
圖4:使用dCas9-KRAB急性耗竭NSD家族成員證實了與NSD1缺失相關的SL表型
A. 在表達dCas9-KRAB的SETD2野生型/突變型786-O細胞系中，通過qRT-PCR分析詳細說明各個NSD因子的特異性耗竭情況。
B. 在786-O野生型細胞中，通過CRISPRi耗竭各個NSD因子后，對整體H3K36甲基化狀態進行Western blot分析。
C. 評估在CRISPRi耗竭靶因子后細胞的相對適應性的細胞競爭/譜系追蹤實驗示意圖。
D. 在786-O野生型和突變型CRISPRi細胞系中，NSD1耗竭（左）、NSD2耗竭（中）和NSD3耗竭（右）細胞的相對貢獻。
E. 在CRISPRi耗竭NSD1、NSD2和NSD3后，786-O和A498同源細胞系的集落形成實驗。
F. 集落形成實驗的定量分析。
（5）DNA損傷和凋亡是SETD2突變型SL表型的基礎
為了闡明SL表型背后的細胞效應，研究人員在ccRCC同基因模型中進行RNA-seq以定義SL的基因特征。
圖5：轉錄組分析揭示了與DNA損傷和凋亡相關的SL基因特征
A. 揭示A498和786-O同源模型中SL基因特征的轉錄組方法示意圖。
B. A498親本和SET-HDR細胞系的RNA-seq的主成分分析（PCA）圖，這些細胞系經過sgCTRL、sgNSD1和sgNSD2轉導和選擇。
C. A498親本/sgNSD1樣本與A498親本/sgCTRL + A498 SET-HDR/sgNSD1（SETD2/NSD1雙敲除與剩余）之間的差異基因表達MA圖以揭示與模型相關的SL基因。
D. A498和786-O SL基因集的GSEA通路熱圖。
E. A498和786-O SL樣本中與凋亡和細胞防御相關信號的增強GSEA富集圖。
F. A498和786-O SL基因集中共同上調和下調的基因維恩圖。
G. 特異性耗竭NSD1、NSD2和NSD3的A498和786-O同源系中，相對caspase 3/7活性。
H. 在CRISPRi耗竭NSD1后，786-O突變細胞中caspase 3/7活性的升高FACs圖。
I. 在CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后，786-O野生型和突變細胞中DNA雙鏈斷裂標記物γ-H2AX以及caspase 3/7活性FACs染色分析。
（6）差異性H3K36me2靶向突出NSD1和NSD2的不同活性
研究發現，盡管NSD1和NSD2都能催化H3K36me2，但它們在基因組上的作用位點和功能存在顯著差異。NSD1主要靶向增強子區域，而NSD2主要靶向基因體區域。
圖6：NSD1和NSD2的分子活性差異揭示其在指導SETD2突變SL中的不同活性
A. 786-O野生型細胞通過CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后H3K36me2標記的差異性ChIP-seq結果火山圖。NSD1特異性peaks（紫色）；NSD2特異性peaks（金色）；共有peaks（黑色）。
B. 在786-O野生型細胞中，對NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2 peaks進行ChromHMM建模，對比H3K36me3、H3K36me2、H3K27ac、H3K27me2、H3K27me3和H3K4me1。
C. DeepTools分析NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2 peaks及其對H3K36me3相互調控。
D. NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2與H3K4me1和H3K36me3的重疊情況標簽密度圖。
E. A498親本細胞中sgNSD1與sgNSD2的差異基因表達MA圖。
F. A498親本細胞CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后，與SL基因CD82和IL6對應的基因位點上H3K36me2 peaks（金色）的基因水平視圖。陰影區域表示NSD1特異性H3K36me2丟失。
（7）SETD2突變的ccRCC細胞系對NSD1的藥理抑制敏感
使用BT5抑制NSD1能夠模擬NSD1基因敲除效應，SETD2突變細胞對BT5表現出更高的敏感性，這為開發靶向SETD2突變癌癥的表觀遺傳治療提供了有力的證據。
圖7：使用BT5抑制NSD1重現SETD2突變SL的遺傳模型
A. 為評估在特定抑制劑處理下，共培養中SETD2野生型/突變型細胞的相對適應性，使用活細胞顯微鏡進行細胞競爭/譜系追蹤實驗。
B. 在SETD2功能正常細胞的共培養中，經不同濃度BT5處理后，SETD2突變型786-O（左）和A498（右）的相對貢獻。
C. 786-O和A498同源細胞系在不同濃度BT5處理下的藥代動力學分析。
D. 經不同濃度BT5處理3天后，整體H3K36甲基化水平的Western blot分析。
E. 經5μM BT5（藥理學）處理或通過CRISPRi耗竭NSD1（遺傳學）處理的786-O SETD2突變細胞中差異表達基因的重疊情況維恩圖。
F. 比較BT5藥理學抑制和CRISPRi抑制之間共有差異表達基因相關性圖。
G. 在SETD2突變和H3K36me3（藍色）丟失下，NSD1介導的H3K36me2（黃色）在維持基因組保真度中的補償作用模型圖。
易小結
本研究揭示了SETD2缺失細胞對NSD1介導的H3K36甲基化的特有敏感性，并提出了通過靶向NSD1來治療SETD2突變癌癥的新策略。研究結果不僅增進了對SETD2在癌癥中作用機制的理解，還為開發新型表觀遺傳治療藥物提供了重要的理論依據。
ChIP-seq在本研究中的作用
參考文獻：
Wagner RT,et al. SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to epigenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation. Genome Biol. 2025 Feb 5;26(1):22. pii: 10.1186/s13059-025-03483-z. doi: 10.1186/s13059-025-03483-z.
lysine 36,tri-methylation）蛋白的表觀遺傳因子。H3K36me3在RNA剪接、DNA修復和轉錄起始調控等多種細胞過程中發揮重要作用，SETD2突變與多種癌癥的發生發展密切相關，尤其是在透明細胞腎細胞癌（clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）中，SETD2突變與不良預后相關。然而，SETD2功能喪失型突變的靶向治療一直是一個挑戰。
近日，美國梅奧診所分子藥理學和實驗治療學系Keith D. Robertson團隊聯合美國南卡醫科大學 (MUSC) Hollings癌癥中心Thai H. Ho，合作探索了SETD2功能喪失型突變在癌癥中的作用機制，并尋找靶向這種突變的新型表觀遺傳靶向治療方法。研究通過一系列的實驗，包括基因組范圍內的合成致死（synthetic lethal, SL）篩選、基因編輯、表觀遺傳分析（ChIP-seq）和藥物驗證等，揭示了SETD2缺失細胞對NSD1（nuclear receptor-binding SET domain protein 1）介導的H3K36甲基化具有特有敏感性，并提出了基于表觀遺傳修飾的個性化治療策略。相關研究成果以《SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to ePIgenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation》為題發表于《Genome Biology》期刊。
標題：SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to epigenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation（SETD2功能喪失型突變使細胞對NSD1介導的H3K36甲基化的表觀遺傳靶向治療具有獨特敏感性）
期刊：Genome Biology
影響因子：IF10.1/Q1
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq等
本研究首先采用了一種無偏倚的全基因組范圍的合成致死篩選方法，鑒定出另一個H3K36me 的writer因子NSD1是SETD2突變細胞中的合成致死（SL）修飾因子，并在小鼠和人類的同源透明細胞腎細胞癌和永生化腎上皮細胞系中驗證了這種合成致死相互作用。通過CRISPRi靶向方法耗盡NSD1，會促進SETD2突變細胞丟失，同時伴隨DNA損傷和凋亡水平升高。但只有抑制NSD1（非其他相關H3K36甲基轉移酶）才會在這些模型中促進合成致死性。分別對NSD1和NSD2的基因組H3K36me2靶向進行作圖，揭示了這些表觀遺傳writer因子的特異性功能。此外研究還通過使用BT5（一種靶向NSD1的首創藥物抑制劑）重現這種合成致死表型進行概念驗證，表明了靶向這種合成致死相互作用的治療可行性。
本研究將全基因組篩選方法與最新的遺傳和藥理學建模方法相結合，揭示了一種全新的表觀遺傳方法，用于靶向癌癥中具有挑戰性的SETD2功能喪失突變進行個性化治療。
研究方法
合成致死篩選：研究者利用CRISPR/Cas9技術在SETD2野生型和突變型的HAP1細胞系中進行基因組范圍的篩選，尋找與SETD2缺失具有合成致死關系的基因。
基因編輯和細胞模型構建：通過CRISPR/Cas9技術，研究者在多種細胞系中構建了SETD2野生型和突變型的同源細胞模型，包括ccRCC細胞系786-O和A498，以及小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）。
表觀遺傳分析：研究者利用ChIP-seq（染色質免疫沉淀測序）技術分析了H3K36me2和H3K36me3在基因組上的分布情況，以了解SETD2缺失對組蛋白修飾的影響。
藥物驗證：研究者使用BT5（一種針對NSD1的小分子抑制劑）驗證了通過藥物抑制NSD1是否能夠模擬基因敲除NSD1的合成致死效應。
結果圖形
（1）CRISPR/Cas9篩選揭示NSD1是SETD2突變人和小鼠細胞中的合成致死（SL）修飾因子
通過CRISPR/Cas9篩選，研究者發現NSD1是SETD2缺失細胞的合成致死修飾因子。在SETD2突變的細胞中，NSD1缺失會導致細胞活力顯著下降，伴隨DNA損傷和凋亡水平升高。
圖1：全基因組篩選鑒定NSD1為SETD2缺失細胞中的潛在SL修飾因子。
A. 對同源SETD2野生型/突變型HAP1細胞中整體H3K36甲基化狀態的Western blot分析。
B. CRISPR/Cas9合成致死篩選的示意圖。
C. 火山圖突出顯示NSD1為合成致死靶點。
D. 對篩選出的127個SL候選基因進行GO分析，發現在參與表觀遺傳重塑和DNA損傷/修復因子中富集。
E. 基因視圖示意圖，展示通過Cre-lox切除第6外顯子實現MEFs中Setd2的誘導性缺失。
F. PCR基因分型確認在Setd2flox/flox親本和Setd2flox/flox；Nsd1-/- MEF細胞系中他莫昔芬（tamoxifen）誘導的Cre活性。
G. Setd2flox/flox和Setd2flox/flox；Nsd1-/- MEF細胞系經4-OHT處理后結晶紫染色。
（2）通過基因組編輯驗證新型SETD2同源/缺失ccRCC模型
SETD2功能缺失突變在多種不同的癌癥類型中很常見，但在ccRCC中最常見，其中SETD2缺失促進腫瘤進展和轉移。因此研究人員選擇ccRCC細胞系786O和A498作為模型，以進一步探究NSD1在驅動SETD2突變體SL中的作用。
圖2：同源SETD2突變的失活/激活功能模型在透明細胞腎細胞癌（ccRCC）中的應用A. 基因組示意圖突出顯示A498細胞系中SETD2的內源性突變以及用于通過同源重組（HR）修復2個核苷酸缺失的基因組編輯策略。
B. 在HR和Cre介導的選擇載體（selection cassette）切除后，對“修復”的A498（SET-HDR）細胞系進行PCR基因分型。
C. 通過Sanger測序色譜圖確認A498 SET-HDR細胞系中“TG”缺失的修復。
D. 在4×放大倍數下，對A498親本和SET-HDR細胞系進行明場形態學評估。
E. 對源自A498和786-O ccRCC細胞系的SETD2功能正常/缺失細胞系進行整體H3K36甲基化狀態的Western blot分析。
F. 通過ChIP-seq揭示的A498 SET-HDR和FLAG-SETD2拯救系中H3K36me3增加的火山圖。
G. A498親本、SET-HDR和FLAG-SETD2系中H3K36me3峰的標簽密度圖。
H. 對應于A498和786O ccRCC細胞系的野生型、SETD2突變和拯救細胞系中H3K36me3 peaks的基因水平視圖。
（3）轉錄組學/表觀基因組分析揭示H3K36me2在SETD2突變細胞中的潛在補償作用
表觀基因組（ChIP-seq）和轉錄組（RNA-seq）揭示SETD2缺失導致H3K36me3整體性丟失，而H3K36me2在基因組上的分布發生了顯著變化，特別是在SETD2缺失的細胞中，H3K36me2增加可能作為一種補償機制來維持基因組的穩定性。
圖3：SETD2/H3K36me3丟失導致的表觀遺傳重組增加了H3K36me2標記的普遍性
A-C. MA圖展示A498、786O和RPTEC同源模型中SETD2突變的差異基因表達。
D. A498、786O、RPTEC同源模型中SETD2突變及一組TCGA-KIRC的SETD2野生型/突變樣本的差異基因表達GSEA通路熱圖。
E. ccRCC模型中與干擾素信號和PD-1信號相關的SETD2依賴性調控的重疊GSEA富集圖。
F.在FLAG-SETD2拯救后，786-O突變細胞與野生型細胞（x軸）中差異表達基因逆轉（y軸）相關性圖。紅點表示在A498同源模型中觀察到的共有差異表達。
G. SETD2突變同源模型H3K36me3丟失peaks(黑色)和H3K36me2增加peaks(金色)火山圖。
H. A498和786O同源ccRCC中基因水平的H3K36me3(黑色)和H3K36me2(金色)peaks視圖。
(4) ccRCC細胞系通過CRISPRi抑制NSD1（而非NSD2或NSD3）能夠重現SETD2突變的SL表型
圖4:使用dCas9-KRAB急性耗竭NSD家族成員證實了與NSD1缺失相關的SL表型A. 在表達dCas9-KRAB的SETD2野生型/突變型786-O細胞系中，通過qRT-PCR分析詳細說明各個NSD因子的特異性耗竭情況。
B. 在786-O野生型細胞中，通過CRISPRi耗竭各個NSD因子后，對整體H3K36甲基化狀態進行Western blot分析。
C. 評估在CRISPRi耗竭靶因子后細胞的相對適應性的細胞競爭/譜系追蹤實驗示意圖。
D. 在786-O野生型和突變型CRISPRi細胞系中，NSD1耗竭（左）、NSD2耗竭（中）和NSD3耗竭（右）細胞的相對貢獻。
E. 在CRISPRi耗竭NSD1、NSD2和NSD3后，786-O和A498同源細胞系的集落形成實驗。
F. 集落形成實驗的定量分析。
（5）DNA損傷和凋亡是SETD2突變型SL表型的基礎
為了闡明SL表型背后的細胞效應，研究人員在ccRCC同基因模型中進行RNA-seq以定義SL的基因特征。
圖5：轉錄組分析揭示了與DNA損傷和凋亡相關的SL基因特征
A. 揭示A498和786-O同源模型中SL基因特征的轉錄組方法示意圖。
B. A498親本和SET-HDR細胞系的RNA-seq的主成分分析（PCA）圖，這些細胞系經過sgCTRL、sgNSD1和sgNSD2轉導和選擇。
C. A498親本/sgNSD1樣本與A498親本/sgCTRL + A498 SET-HDR/sgNSD1（SETD2/NSD1雙敲除與剩余）之間的差異基因表達MA圖以揭示與模型相關的SL基因。
D. A498和786-O SL基因集的GSEA通路熱圖。
E. A498和786-O SL樣本中與凋亡和細胞防御相關信號的增強GSEA富集圖。
F. A498和786-O SL基因集中共同上調和下調的基因維恩圖。
G. 特異性耗竭NSD1、NSD2和NSD3的A498和786-O同源系中，相對caspase 3/7活性。
H. 在CRISPRi耗竭NSD1后，786-O突變細胞中caspase 3/7活性的升高FACs圖。
I. 在CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后，786-O野生型和突變細胞中DNA雙鏈斷裂標記物γ-H2AX以及caspase 3/7活性FACs染色分析。
（6）差異性H3K36me2靶向突出NSD1和NSD2的不同活性
研究發現，盡管NSD1和NSD2都能催化H3K36me2，但它們在基因組上的作用位點和功能存在顯著差異。NSD1主要靶向增強子區域，而NSD2主要靶向基因體區域。
圖6：NSD1和NSD2的分子活性差異揭示其在指導SETD2突變SL中的不同活性A. 786-O野生型細胞通過CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后H3K36me2標記的差異性ChIP-seq結果火山圖。NSD1特異性peaks（紫色）；NSD2特異性peaks（金色）；共有peaks（黑色）。
B. 在786-O野生型細胞中，對NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2 peaks進行ChromHMM建模，對比H3K36me3、H3K36me2、H3K27ac、H3K27me2、H3K27me3和H3K4me1。
C. DeepTools分析NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2 peaks及其對H3K36me3相互調控。
D. NSD1特異性和NSD2特異性H3K36me2與H3K4me1和H3K36me3的重疊情況標簽密度圖。
E. A498親本細胞中sgNSD1與sgNSD2的差異基因表達MA圖。
F. A498親本細胞CRISPRi耗竭NSD1或NSD2后，與SL基因CD82和IL6對應的基因位點上H3K36me2 peaks（金色）的基因水平視圖。陰影區域表示NSD1特異性H3K36me2丟失。
（7）SETD2突變的ccRCC細胞系對NSD1的藥理抑制敏感
使用BT5抑制NSD1能夠模擬NSD1基因敲除效應，SETD2突變細胞對BT5表現出更高的敏感性，這為開發靶向SETD2突變癌癥的表觀遺傳治療提供了有力的證據。
圖7：使用BT5抑制NSD1重現SETD2突變SL的遺傳模型
A. 為評估在特定抑制劑處理下，共培養中SETD2野生型/突變型細胞的相對適應性，使用活細胞顯微鏡進行細胞競爭/譜系追蹤實驗。
B. 在SETD2功能正常細胞的共培養中，經不同濃度BT5處理后，SETD2突變型786-O（左）和A498（右）的相對貢獻。
C. 786-O和A498同源細胞系在不同濃度BT5處理下的藥代動力學分析。
D. 經不同濃度BT5處理3天后，整體H3K36甲基化水平的Western blot分析。
E. 經5μM BT5（藥理學）處理或通過CRISPRi耗竭NSD1（遺傳學）處理的786-O SETD2突變細胞中差異表達基因的重疊情況維恩圖。
F. 比較BT5藥理學抑制和CRISPRi抑制之間共有差異表達基因相關性圖。
G. 在SETD2突變和H3K36me3（藍色）丟失下，NSD1介導的H3K36me2（黃色）在維持基因組保真度中的補償作用模型圖。
易小結
本研究揭示了SETD2缺失細胞對NSD1介導的H3K36甲基化的特有敏感性，并提出了通過靶向NSD1來治療SETD2突變癌癥的新策略。研究結果不僅增進了對SETD2在癌癥中作用機制的理解，還為開發新型表觀遺傳治療藥物提供了重要的理論依據。
ChIP-seq在本研究中的作用
- 分析組蛋白修飾的變化：通過ChIP-seq，研究者精確地分析H3K36me2和H3K36me3在基因組上的分布變化，從而揭示SETD2缺失對組蛋白修飾的整體性影響。
- 揭示NSD1和NSD2的功能差異：ChIP-seq結果顯示NSD1和NSD2在基因組上的靶向位點不同，這一發現對于理解它們在SETD2缺失細胞中的不同作用機制至關重要。
- 驗證藥物作用機制：通過比較BT5處理前后的H3K36me2分布，研究者驗證BT5是否通過抑制NSD1的活性來影響組蛋白修飾，從而進一步確認藥物的作用機制。
參考文獻：
Wagner RT,et al. SETD2 loss-of-function uniquely sensitizes cells to epigenetic targeting of NSD1-directed H3K36 methylation. Genome Biol. 2025 Feb 5;26(1):22. pii: 10.1186/s13059-025-03483-z. doi: 10.1186/s13059-025-03483-z.
