通常，細(xì)胞或組織中的特異性 Marker 意味著啟動(dòng)子的活性在這種細(xì)胞類型中相對(duì)較高，而并非在其他細(xì)胞中完全不表達(dá)。在其他細(xì)胞中，目的啟動(dòng)子也可能被弱激活，這種現(xiàn)象也被叫做異位表達(dá)。異位表達(dá)對(duì)譜系追蹤的影響很大，常常會(huì)導(dǎo)致一些關(guān)于細(xì)胞命運(yùn)的爭(zhēng)議。

圖. 異位表達(dá)對(duì)譜系示蹤的影響^[1]

為了更精準(zhǔn)的標(biāo)記特定細(xì)胞類型，避免異位表達(dá)的影響，我們可以借助兩個(gè)（甚至以上）的 Marker 進(jìn)行標(biāo)記，那么在小鼠中利用多個(gè) Marker 標(biāo)記時(shí)，我們就涉及到了使用多種重組酶與報(bào)告基因小鼠。

譜系示蹤系類課程往期回顧：
【譜系示蹤系列第一期】基礎(chǔ)細(xì)胞標(biāo)記方式
【譜系示蹤系列第二期】單重組酶介導(dǎo)的多色報(bào)告系統(tǒng)方法
【譜系示蹤系列第三期】多重組酶介導(dǎo)的交叉報(bào)告基因方法
譜系示蹤的難點(diǎn)——基因標(biāo)記的異位表達(dá)如何避免？（上） 
譜系示蹤的難點(diǎn)——基因標(biāo)記的異位表達(dá)如何避免？（中）

前幾期，我們?yōu)榇蠹抑v述的幾種避免基因異位表達(dá)的系統(tǒng)均是針對(duì)報(bào)告基因小鼠進(jìn)行相應(yīng)改造，利用報(bào)告基因小鼠上的多對(duì)重組位點(diǎn)與報(bào)告基因的交錯(cuò)排列來(lái)實(shí)現(xiàn)標(biāo)記不同細(xì)胞類型的目的。那么，是否存在針對(duì)重組酶設(shè)計(jì)的系統(tǒng)呢？

roxCre遺傳策略

roxCre 是將 rox-Stop-rox（RSR）插入 Cre 編碼區(qū)前或編碼區(qū)中，在移除 Stop 序列之前，Cre 無(wú)法正確進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。將該小鼠與另一個(gè) Marker 基因啟動(dòng)的 Dre 小鼠進(jìn)行交配后，Dre 介導(dǎo) RSR 之間發(fā)生重組將 Stop 序列去除后，該 Cre 才能正常發(fā)揮功能。

圖. roxCre 小鼠的兩種類型

有同學(xué)會(huì)提問(wèn)，當(dāng) RSR 插入 Cre 編碼區(qū)時(shí)，即使通過(guò) Dre-rox 重組去除 RSR 后，在其編碼序列中會(huì)包含一個(gè)剩余的 rox 位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)是否會(huì)影響 Cre 的重組效率呢？
 

中科院周斌團(tuán)隊(duì)對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)研究，研究者在 Cre 的12個(gè)不同位點(diǎn)分別插入了 rox 序列，其中大部分位于螺旋結(jié)構(gòu)域之間。由于插入額外的 rox 氨基酸會(huì)改變 Cre 的原始序列，他們將這種包含剩余 rox 位點(diǎn)的 Cre 稱為 mCre。研究者通過(guò)通過(guò)用12個(gè)版本的 mCre（mCre1~mCre12）和響應(yīng)的GFP報(bào)告基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞來(lái)篩選它們的重組效率。結(jié)果證明，mCre1、2、3、4、6、7、10和11的效率與傳統(tǒng)Cre相當(dāng)。說(shuō)明通過(guò)合適的插入位點(diǎn)設(shè)計(jì)，包含 rox 位點(diǎn)的 Cre 與 普通 Cre 的重組效率可保持一致。
 

圖. 12種不同插入位點(diǎn)的mCre小鼠的重組效率檢測(cè)^[2]

那么，這種 roxCre 遺傳策略如何幫助我們精確標(biāo)記細(xì)胞群呢？

若我們想標(biāo)記 A⁺B⁺ 細(xì)胞，我們就可以利用啟動(dòng)子 A 介導(dǎo)的 roxCre 小鼠、啟動(dòng)子 B 驅(qū)動(dòng)的 Dre 小鼠、以及 LSL-Reporter 小鼠進(jìn)行交配：
 

圖. roxCre 小鼠的基因重組圖解

1 A⁺B^- 細(xì)胞或A^-B⁺ 細(xì)胞：
僅 makerA 表達(dá)時(shí)，Cre 由于RSR的存在而無(wú)法正確進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，該類型細(xì)胞無(wú)法被標(biāo)記。僅makerB 表達(dá)時(shí)，Dre 酶 無(wú)法重組 Loxp 位點(diǎn)，細(xì)胞無(wú)法被標(biāo)記。

2 A⁺B⁺ 細(xì)胞：
makerB 介導(dǎo) Dre 表達(dá)，Dre 酶會(huì)切除 roxCre 系統(tǒng)中兩個(gè) Rox 位點(diǎn)之間的 stop 序列。makerA 可介導(dǎo) Cre 酶表達(dá)，Cre 酶重組報(bào)告小鼠的 Loxp 位點(diǎn)，去除 LSL 中的Stop序列。因此，該類型細(xì)胞被 Reporter 基因標(biāo)記。

案例1

損傷后出現(xiàn)的過(guò)多的心肌成纖維細(xì)胞是組織纖維化的關(guān)鍵因素。經(jīng)前期研究，心肌成纖維細(xì)胞主要來(lái)源于心外膜與心內(nèi)膜。由于心內(nèi)膜細(xì)胞與心外膜細(xì)胞功能上的差異，研究者懷疑來(lái)自不同來(lái)源的成纖維細(xì)胞在心臟纖維化期間可能表現(xiàn)出不同的功能。為探索這一問(wèn)題，研究者首先需準(zhǔn)確標(biāo)記不同來(lái)源的心肌成纖維細(xì)胞。

以心內(nèi)膜衍生成纖維細(xì)胞為例，研究者利用了心內(nèi)膜細(xì)胞marker Col1a2 與成纖維細(xì)胞 marker Nfatc1，構(gòu)建了以下小鼠：Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP。
 

圖. Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP小鼠的基因重組圖解^[3]

關(guān)于 Col1a2-RSR-CreER，激活 CreER 需要 Dre 和 TAM 兩者共同存在。因此，在 TAM 誘導(dǎo)下，該小鼠可以標(biāo)記 Col1a2 與 Nfatc1 雙陽(yáng)性細(xì)胞，即心內(nèi)膜衍生成纖維細(xì)胞。

圖. 使用roxCreER準(zhǔn)確標(biāo)記心內(nèi)膜衍生成纖維細(xì)胞^[3]

除上述通過(guò)加入 Stop 序列來(lái)調(diào)控 Cre 酶的活性的 roxCre 遺傳策略外，還有另一種思路，同樣也可以達(dá)到使用一種重組酶，調(diào)控另一種重組酶重組活性的策略。那就是 CrexER 遺傳策略。

CrexER 遺傳策略

CrexER 策略是通過(guò)將兩個(gè) rox 位點(diǎn)插入到 CreER cDNA 的雌激素受體編碼區(qū)的兩側(cè)，形成了可切換的 CreER 重組酶。由于 ER 的影響，在理想情況下，Cre-ER 蛋白是位于細(xì)胞質(zhì)的，無(wú)法入核發(fā)揮重組酶活性，而將該小鼠與另一個(gè) Marker 基因啟動(dòng)的 Dre 小鼠進(jìn)行交配后，Dre 介導(dǎo) RSR 之間的重組并將ER區(qū)去除，該 Cre 即可正常發(fā)揮功能。

圖. CrexER小鼠的基因重組圖解^[4]

與前一套遺傳策略相似，CrexER 遺傳策略同樣適用于標(biāo)記 A⁺B⁺ 細(xì)胞。

案例2
據(jù)報(bào)道，間皮細(xì)胞標(biāo)志物 Wt1 在發(fā)育中的冠狀動(dòng)脈血管中表達(dá)，但在其他血管中不表達(dá)，并且Wt1-CreER 小鼠可標(biāo)記心外膜細(xì)胞與胚胎心臟中的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。而第二個(gè)標(biāo)記物 Tie2 是泛內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，在大多數(shù)血管以及某些髓系細(xì)胞群中表達(dá)。

研究者關(guān)注的是冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，因而他們構(gòu)建了以下的小鼠：Tie2-Dre;Wt1-CrexER;R26-LSL-tdTomato。
 

圖. Tie2-Dre;Wt1-CrexER;R26-LSL-tdTomato 小鼠的基因重組圖解^[4]

利用 CrexER 系統(tǒng)，他們精準(zhǔn)標(biāo)記到了 Wt1 和 Tie2 的雙陽(yáng)性的細(xì)胞群，經(jīng)過(guò)檢測(cè)，被標(biāo)記為紅色的細(xì)胞群中致密心肌中內(nèi)皮細(xì)胞占比 97.15%±0.61%。

圖. 使用 CrexER 準(zhǔn)確標(biāo)記心肌中內(nèi)皮細(xì)胞^[4].

CDH3 為心肌內(nèi)皮細(xì)胞的另一 Marker。圖中紅色（CrexER 策略）與綠色（CDH3 標(biāo)記）信號(hào)基本一致。

上述講述的兩種對(duì)重組酶的改造方案，可標(biāo)記的細(xì)胞類型均為A⁺B⁺ 細(xì)胞群。下面介紹一種可標(biāo)記A⁺B^- 細(xì)胞的重組酶改造方式。

dCreER 遺傳策略

dCreER 策略是通過(guò)將兩個(gè) rox 位點(diǎn)插入到 CreER 整體編碼區(qū)的兩側(cè)，整段 CreER 均可以被 Dre 重組酶刪除。由于這樣的設(shè)計(jì)，因而導(dǎo)致當(dāng) Dre 酶不存在時(shí)，CreER 正常表達(dá)行使功能，當(dāng) Dre 酶存在時(shí)，CreER 序列被剪切，無(wú)法進(jìn)行表達(dá)或翻譯。
 

圖. dCreER 小鼠的基因重組圖解

如上圖所示，dCreER 遺傳策略適用于標(biāo)記 A⁺B^- 細(xì)胞。

案例3
哺乳動(dòng)物的脂肪組織有兩種不同類型：WAT 和 BAT。目前沒(méi)有很好的標(biāo)記 WAT 的 marker，主要方式還是依靠泛脂肪 marker PLIN1，而 BAT 可以使用棕色脂肪組織 marker UCP1 進(jìn)行標(biāo)記。

因而研究者利用 dCreER 遺傳策略，構(gòu)建了 Plin1-dCreER;Ucp1-Dre;R26-tdTomato 小鼠（下述將 Plin1-dCreER;Ucp1-Dre 交配小鼠稱為 WA-iCre 小鼠）
 

圖. WA-iCre;R26-tdTomato 小鼠的基因重組圖解^[5]

在 WAT 中，PLIN1 正常表達(dá)，UCP1 不表達(dá)，因而在 TAM 的作用下，細(xì)胞被標(biāo)記為紅色；在 BAT 中，UCP1 表達(dá)，進(jìn)而 Dre 介導(dǎo)兩個(gè) Rox 位點(diǎn)發(fā)生重組，PLIN1 之后的 CreER 酶被去除，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法被標(biāo)記上顏色。
 

圖. 使用 dCreER 準(zhǔn)確標(biāo)記 WAT 細(xì)胞^[5]

以上是在譜系示蹤中對(duì)重組酶的幾種改造方案，經(jīng)過(guò)改造后，一種重組酶的活性可受到另一種重組酶的調(diào)控，這種制約關(guān)系可幫助我們精準(zhǔn)地標(biāo)記目的細(xì)胞。

關(guān)于譜系示蹤的各類工具介紹已經(jīng)講述完畢，雖然涉及的類型非常多，應(yīng)用也較為繁瑣，但可以幫助我們快速檢索目的細(xì)胞，明確細(xì)胞命運(yùn)。最后一期，我們將對(duì)前面講述的的各類工具進(jìn)行一個(gè)梳理，并為您介紹這些工具相互連用的進(jìn)階案例，大家敬請(qǐng)期待~

Reference：
[1] He L, Li Y, Li Y, Pu W, Huang X, Tian X, Wang Y, Zhang H, Liu Q, Zhang L, Zhao H, Tang J, Ji H, CAI D, Han Z, Han Z, Nie Y, Hu S, Wang QD, Sun R, Fei J, Wang F, Chen T, Yan Y, Huang H, Pu WT, Zhou B. Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases. Nat Med. 2017 Dec;23(12):1488-1498. doi: 10.1038/nm.4437. Epub 2017 Nov 13. PMID: 29131159; PMCID: PMC6913096.
[2] Shi Mengyang, Li Jie, Liu Xiuxiu, Liu Kuo, Pu Wenjuan, Weng Wendong, Zhang Shaohua, Zhao Huan, Lui Kathy O., Zhou Bin (2024) The robust, high-throughput, and temporally regulated roxCre and loxCre reporting systems for genetic modifications in vivo eLife 13:RP97717 https://doi.org/10.7554/eLife.97717.1
[3] Han, M., Liu, Z., Liu, L. et al. Dual genetic tracing reveals a unique fibroblast subpopulation modulating cardiac fibrosis. Nat Genet 55, 665–678 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-023-01337-7
[4] Pu W, He L, Han X, Tian X, Li Y, Zhang H, Liu Q, Huang X, Zhang L, Wang QD, Yu Z, Yang X, Smart N, Zhou B. Genetic Targeting of Organ-Specific Blood Vessels. Circ Res. 2018 Jun 22;123(1):86-99. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.118.312981. Epub 2018 May 15. PMID: 29764841; PMCID: PMC6015762.
[5] Han X, Zhang Z, He L, Zhu H, Li Y, Pu W, Han M, Zhao H, Liu K, Li Y, Huang X, Zhang M, Jin H, Lv Z, Tang J, Wang J, Sun R, Fei J, Tian X, Duan S, Wang QD, Wang L, He B, Zhou B. A suite of new Dre recombinase drivers markedly expands the ability to perform intersectional genetic targeting. Cell Stem Cell. 2021 Jun 3;28(6):1160-1176.e7. doi: 10.1016/j.stem.2021.01.007. Epub 2021 Feb 9. PMID: 33567267.

上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡(jiǎn)稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領(lǐng)域，打造了以基因修飾動(dòng)物模型研發(fā)為核心，涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評(píng)價(jià)等多個(gè)技術(shù)平臺(tái)，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動(dòng)物模型產(chǎn)品解決方案。