PCR擴增目的基因，膠圖總是一片空白？反復摸索退火溫度，膠圖全是雜帶？同學，你需要換一對引物了，一份包教包會的克隆引物設計指南送給你。

引物設計的一般原則
設計引物需要遵循的原則較多，如引物要有特異性，GC含量在40%-60%之間，Tm值在55-65℃，一對引物Tm值與GC含量不能相差太多，長度在16~30 bp為宜，避免一對引物發生互補，3′端不能選擇A，堿基要隨機分布等。

基因克隆引物通常由酶切識別序列和與靶基因互補配對的特異性序列兩部分組成，特異性序列的靶點在基因CDS序列的兩端，是相對固定的。因此克隆引物中的可變序列較少，需在盡量不改變特異性序列的條件下，通過修改酶切識別序列優化引物對。

兩步學會設計克隆引物
1.明確載體多克隆位點處限制酶的種類，并下載目的基因CDS序列。
基因克隆中使用引物一是為了將基因CDS序列從cDNA中大量擴增，便于后續膠回收利用，二是通過酶切將基因連入載體中用于后續實驗。因此需在CDS序列中篩選多克隆位點處所有限制酶的識別序列，選擇載體多克隆位點的限制酶時，應避開在CDS內部存在識別序列的限制酶，否則會導致CDS序列被酶切，進而連入載體的序列不完整。

若CDS序列內含有多克隆位點處所有限制酶識別序列，則考慮更換載體，若無法更換載體則可通過優化不完全酶切時間，獲得酶切的CDS全長序列，或采用無縫克隆試劑盒，跳過酶切步驟。

2. 通過修改酶切識別序列優化引物對。
將所有可用的酶切識別序列分別連接至引物對5’端，可獲得多對引物，利用生信軟件分析不同引物對的GC含量，TM值，序列特異性等信息，獲得評分較高的引物對用于后續實驗。

若評分較高的引物對還是存在GC含量、TM值相差過大，特異性不好等問題，可以通過在酶切識別序列兩端添加1-3bp保護序列，逐步調整和優化引物對。