細胞有幾個核？？？
并非所有細胞都只有1個細胞核喔~    破骨細胞：高度分化的多核細胞，無克隆能力，無法傳代培養，且破骨細胞體外培養較為困難......

Section.01
骨代謝: 背景知識

老樣子，在開始本期內容前，先來點背景知識做“開胃小菜”！ 當然，做骨骼相關研究的小伙伴兒們可自行略過~

首先，我們來了解下有關骨代謝的專業術語！

骨重塑

骨重塑：指的是破骨細胞清除舊骨或受損骨質，并由成骨細胞形成的新骨取代的過程。

骨骼，是一種動態組織。其在人的整個生命過程中是不斷被重塑的。持續重塑是維持骨骼關鍵功能所必需的，它能防止骨損傷的積累，并維持骨骼的機械強度和鈣穩態^[1]。

骨重塑過程由破骨細胞和成骨細胞的“交流”來調控完成^[2]。

• 破骨細胞 (osteoclasts，OCs)：是一種骨吸收細胞，源自造血干細胞，它通過分泌酸性酶和蛋白水解酶來降解骨質。
• 成骨細胞 (Osteoblasts，OBs)：是一種骨形成細胞，它由間充質前體細胞在轉錄因子的連續作用下分化為骨祖細胞譜系而產生，并最終分化為骨細胞。

圖 1. 破骨細胞生成和成骨細胞生成的策略 ^[1] 。

骨礦化

骨礦化： 指的就是鈣的沉淀過程。 鈣、磷等無機鹽沉淀在骨頭組織的過程，就叫骨的礦化。

簡單說，礦化是進化過程中的一種被動選擇。

生物礦化的起源可以追溯到前寒武紀晚期，當時構造活動導致海水中可溶性礦物顯著增加。人們普遍認為，海洋生物首先發展出由碳酸鈣和/或磷酸鈣礦物組成的原始外骨骼，漸漸地，骨骼組織被內化。礦化骨骼強大的承重能力使得大型脊椎動物得以進化 ^[3] 。

作為一種特殊的結締組織， 骨骼具有高度礦化的結構和構造 。一方面，作為內部支撐系統，骨骼可為身體提供結構基礎，并為運動提供肌肉附著點。同時，骨骼還保護大腦和內臟器官，并為骨髓造血組織提供場所。此外，骨骼也是無機離子 (尤其是磷酸鹽和鈣) 的主要來源和儲存地，它們能夠積極參與體內礦物質穩態和能量代謝^[4]。

骨吸收

骨吸收： 指的是骨鈣溶出的過程。 也就是把鈣從骨頭里面“搬”出來。破骨細胞將硬骨組織分解為礦物質，同時將骨骼中的鈣釋放至血液中。

破骨細胞是唯一明確可降解骨的細胞，在骨穩態和健康維持中至關重要。

破骨細胞是一種組織特異性的多核巨噬細胞，由血液及骨髓中的單核/巨噬細胞系分化而來  (圖 2) 。其分化過程經歷破骨細胞前體  (osteoclast precursor cells，OPCs，或稱 preosteoclasts) 、融合的多核破骨細胞  (non-functional polykaryons) 、成熟破骨細胞  (mature osteoclasts，也稱極化的多核破骨細胞)  等幾個階段。
 


圖 2. 破骨細胞分化過程圖 ^[5] 。
下面顯示了阻斷破骨細胞生成和活化的單基因突變。斜體字表示在嚙齒動物和人類中自然發生的突變，而其他則是通過靶向誘變產生無效等位基因的結果。上面顯示的是增加破骨細胞生成和/或活化及存活并導致骨質疏松癥的單基因突變等位基因。請注意，除了 OPG22 和 sRANKL77 轉基因小鼠過表達模型（藍色邊框）外，所有這些突變均為無效突變。

如圖 2 所示，M-CSF（CSF-1）和 RANKL 對破骨細胞生成至關重要，二者缺一不可。 OPG  可以結合并中和 RANKL，從而負向調節破骨細胞生成和成熟破骨細胞的活化。

? RANKL ：核因子 κB 受體活化因子配體 (Receptor Activator for Nuclear Factor-κBLigand，RANKL) 被認為是促進破骨細胞最為分化成熟及其功能活性最重要的因子，由成骨細胞/間充質干細胞分泌，結合破骨細胞前體膜上的 RANK 受體，激活下游 NF-κB、MAPK、NFATc1 通路。

? M-CSF ：巨噬細胞集落刺激因子，可誘導 RANK 在破骨細胞前體的細胞膜上表達，進而使表達 RANK 的破骨前體細胞和 RANKL 結合并產生效應，誘導破骨細胞分化。

目前，已有大量實驗證實破骨細胞形成和功能失調與骨質疏松癥、骨折愈合、骨關節炎和原發性/轉 移性 骨腫瘤等密切相關^[2]。體外誘導破骨細胞分化對研究骨代謝疾病、藥物篩選具有重要作用。

Section.02
破骨細胞的體外誘導

目前破骨細胞主要采用的是骨髓單核細胞誘導法   (bone marrow monocytes，BMMs)  和 RAW264.7 細胞系誘導法兩種方法。

方案一、小鼠骨髓單核細胞誘導破骨細胞

實驗方案

1. 骨髓細胞提取

(1)  取 6-8 周齡小鼠，使用 CO ₂  吸入致死。用 75% 酒精消毒小鼠毛皮。
(2) 取雙側股骨、脛骨，用無菌注射器吸取無菌  PBS  沖洗骨髓腔 3 次，收集液體于 15 mL 離心管中，300×g 4℃ 離心 5 min，棄上清。
(注：避免用力過猛導致細胞機械損傷)
(3)  過 70 -100 μm 細胞篩，1500 rpm 離心 5 min。室溫下紅細胞裂解液 處理 5 min，PBS 洗滌 2 次。
 
圖 3. 骨髓細胞提取示意圖 ^[6] 。

2. BMMs 貼壁篩選

(1)  用 5 mL 含 10% FBS  的 α-MEM 培養基重懸，離心，棄上清。
(2)  用 5 mL 含 M-CSF  (25 ng/mL)  和 10% FBS 的 α-MEM 培養基重懸細胞。接種于 6 孔細胞培養板中  (每只小鼠一孔) ，置于 37°C、5% CO ₂  細胞培養箱中培養過夜。
(3)  收集上清離心，棄上清液  (主要為紅細胞和粒細胞) ，用 5 mL 含有 50 ng/mL M-CSF 的完全培養基重懸后，以 5×10 ⁴  cells/孔的密度接種于 24 孔板中  (每孔 1 mL) ，2-3 天后貼壁細胞即為骨髓來源巨噬細胞；

3. 破骨細胞誘導分化

(1)  棄上清液，用無菌 PBS 清洗 2 次。使用含有 50 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 的完全培養基進行誘導分化；
(2)  細胞每 3 天換一次液，并補加因子 25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL，4-6 天后進行誘導鑒定。

不同孔板建議加入的細胞數和培養液體積
 

 
MCE 客戶驗證
 
圖 4.兩種多發性骨髓瘤細胞條件培養基 和 M-CSF (HY-P7085, 20 ng/L) 誘導正常小鼠原代巨噬細胞破骨形成 ^[7] 。
用 MM 細胞、CM 和 M-CSF (20 ng/L) 處理原代小鼠巨噬細胞，然后進行 TRAP 染色。含有三個以上細胞核且 TRAP 呈陽性的細胞被視為破骨細胞。

方案二、巨噬細胞系 RAW264.7 誘導破骨細胞

實驗方案

(1)  用含 10% FBS 的 α-MEM 培養基將 RAW264.7 細胞制成細胞懸液，以 3×10⁴ cells/孔的密度接種于 24 孔板中。
(2)  細胞接種 12 h 后，加入 RANKL  (20-100 ng/mL) 。每 3 天更換培養基，并同時補加 RANKL  (20-100 ng/mL) 。
(3)  較為明顯的多核破骨細胞將在分化培養 4 天后開始出現，并在第 5 天至第 6 天逐漸變得豐富。

RAW 264.7 細胞表達 M-CSF 及其受體 c-fms。因此，僅加入 RANKL 就足以誘導破骨細胞分化，無需額外加入 M-CSF。

MCE 客戶驗證
 
圖 5. RANKL (HY-P7425, 35 ng/mL) 誘導 5 天后，Raw 264.7 發生破骨細胞分化 ^{[8 ]} 。
TRAP 染色視野和定量分析結果顯示，與對照組相比，RANKL 處理導致 Raw 264.7 多核破骨細胞數量顯著增加 (p < 0.01)。

Section.03
破骨細胞，如何鑒定？

一、形態學鑒定

1. 多核巨細胞

相差顯微鏡下可見 ≥3 個細胞核  (成熟破骨細胞通常含 10–20 個核) 。

2. 偽足結構

活化破骨細胞邊緣呈“皺褶緣”  (ruffled border) ，為骨吸收功能區域。鬼筆環肽染色后共聚焦顯微鏡觀察  (特征性"封箱帶"結構)
 
圖 6.鬼筆環肽對破骨細胞中的足狀體肌動蛋白帶進行染色 ^[9] 。 
M-CSF (30 ng/mL) 和 RANKL (100 ng/mL) 誘導 BMMs 破骨分化。當破骨細胞出現時，用 PBS 輕輕沖洗，用 0.1%  Triton X-100  滲透 30 min，最后用羅丹明偶聯的  Phalloidin  染色，檢測細胞骨架肌動蛋白結構的形成，同時細胞核用  DAPI  復染。

二、功能標志物檢測

1. Trap 染色

破骨細胞產生許多酶，其中主要是抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acidic phosphatase, Trap)， Trap 特異地分布于破骨細胞中，為破骨細胞所特有，通常作為鑒別破骨細胞的重要標志物。

【實操步驟】

• 細胞樣本 (以 48 孔板為例)：

(1)  移除細胞培養液，每孔加入 400 μL PBS 清洗，棄液。
(2) 每孔加入 300 μL 4%  多聚甲醛溶液 ，室溫固定 15-30 min，棄液。
(3)  每孔加入 300 μL PBS，清洗 2 次。
(4)  染色：每孔加入 150-200 μL TRAP 染色液，37℃ 避光孵育 10-15 min  (待測樣品中酒石酸酸性磷酸酶活性較低時，可適當延長孵育時間至 30 分鐘或顯微鏡下顯色至預期深淺) 。
(5)  每孔加入 300 μL PBS，清洗 2 次。
(6)  顯微鏡下觀察和拍照。

2. 骨吸收實驗

骨髓單核細胞  (BMMs) 接種于羥基磷灰石涂層板或骨片，觀察吸收陷窩的情況。

例如，為了檢測體外破骨細胞骨吸收功能的影響，將 BMMs 接種于磷酸鈣涂層仿骨骨分析 Stripwell 板。培養期間，每天補充一次含有 M-CSF、RANKL 的新鮮培養基。10 天后，用超聲波去除骨片表面細胞，用 SEM  (掃描電子顯微鏡)  對吸收凹陷進行成像，并使用 I mageJ 軟件對凹陷面積進行量化。用茜素紅染色液對磷酸鈣涂層仿骨骨分析 Stripwell 板進行染色，并使用共聚焦激光顯微鏡進行拍照，三維重建，觀察骨片中的凹坑 ^[5] 。
 
圖 7. 高鋅環境下的老年骨髓間充質干細胞 (BMSCs) 外泌體能夠抑制破骨細胞分化和骨質破壞 ^[9] 。
(A-B) 不同同牛骨切片上骨吸收凹坑及其吸收區域的代表性掃描電子顯微鏡圖像和（C）切片上 3D 重建的共聚焦顯微鏡觀察。(Con:正常的 BMMs 破骨誘導組; Aged-EXO:不含鋅的老化外泌體處理組; Aged + Zn ²⁺ -EXO:添加鋅的老化外泌體處理組)

三、分子標志物檢測

qPCR/WB 檢測  Trap 、 NFATc1 、 CTSK   (組織蛋白酶 K) 、DC-STAMP (細胞融合相關蛋白)。

qPCR/WB 技術實操不在贅述，需要的小伙伴可參考往期推文： 從基礎到進階：PCR、qPCR 和 RT-PCR 不是一回事兒？(內含 Protocol) ； 干貨分享 | WB 常見問題及解決方案  

實驗小提示

(1) RAW264.7 細胞在含有 10% FBS 的  RPMI-1640  或  DEME  培養基中可以增殖并保持其分化為破骨細胞的能力，而其在含有 10% FBS 的 α-MEM 中培養可進行破骨細胞分化試驗。
(2)  RAW264.7 分化為破骨細胞的成功與否與細胞狀態密切相關，建議使用 15 代以內的 RAW264.7 細胞。
(3)  分化誘導培養基工作液建議現配現用，使用前注意 37 ℃ 溫育。
(4)  使用的 RANKL 和 M-CSF 濃度可能因小鼠和實驗室條件而異。
(5)  破骨細胞形成初期，細胞呈紡錘形，成熟后，細胞變大，多核，呈圓形。從 RANKL 和 M-CSF 添加后的第 4 天起，每天至少觀察一次細胞，因為小鼠破骨細胞在完全分化后非常不穩定。
(6)  誘導成功后立即進行染色，小鼠破骨細胞在成熟后 24 h 內死亡。
 

產品推薦

RANKL/TNFSF11 Protein, Mouse (HY-P7425) RANKL 是 RANK 的激活劑。當與 RANK 結合后，其誘導單核細胞/巨噬細胞譜系細胞分化為破骨細胞，并進一步導致破骨細胞前體成熟。

M-CSF Protein, Mouse (HY-P7085) M-CSF 是調節造血前體細胞（特別是單核吞噬細胞，包括巨噬細胞和單核細胞）存活、增殖和分化的關鍵協調因子。

TNFRSF11B/OPG Protein, Mouse (HEK293, His) (HY-P71017) 競爭性抑制 RANKL-RANK 結合，負調控破骨細胞生成。

Red Blood Cell Lysis Buffer (HY-3010) 即用型溶液，能快速、有效的從人或鼠等的血液或組織樣品中裂解并去除無核紅細胞，不影響白細胞、正常組織或腫瘤細胞。

DMEM (High Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, no HEPES) (HY-K3001) 廣泛使用的基礎培養基。

Rhodamine Phalloidin (HY-K0903) 羅丹明偶聯的 Phalloidin，檢測細胞骨架肌動蛋白結構的形成。

TRAP Antibody (YA2321) (HY-P82576) 適用于 Human, Mouse, Rat 的 WB, IHC-P, ICC/IF, IP。

NFAT2 Antibody (HY-P80243) 適用于 Human 的 WB, IHC-P, FC。

 

[1] Kim JM, et al. Osteoblast-Osteoclast Communication and Bone Homeostasis. Cells. 2020 Sep 10;9(9):2073. 
[2] DONG Shiwu, et al. Break and then stand: novel insight into osteoclast functions in the skeletal system[J]. Journal of Army Medical University, 2022, 44(1): 79-88. 
[3] Murshed M. Mechanism of Bone Mineralization. Cold Spring Harb Perspect Med. 2018 Dec 3;8(12):a031229. Erratum in: Cold Spring Harb Perspect Med. 2020 Aug 3;10(8):a040667. 
[4] Shi C,et al. Recent advances in bone-targeted therapy. Pharmacol Ther. 2020 Mar;207:107473. 
[5] Boyle WJ, et al. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003 May 15;423(6937):337-42. 
[6] Toda G, et al. Preparation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice for functional analysis. STAR Protoc. 2020 Dec 31;2(1):100246. 
[7] Sun W, et al. Sulforaphane inhibits multiple myeloma cell-induced osteoclast differentiation and macrophage proliferation by elevating ferroportin1. Cancer Chemother Pharmacol. 2024 Dec 11;95(1):3.
[8] Wen L, et al. TFAP2B governs the regulation of SIRT1 to inhibit osteoclast-induced bone destruction. Biochem Biophys Res Commun. 2025 Mar 8;752:151410.
[9] Yin S, et al. Dominoes with interlocking consequences triggered by zinc: involvement of microelement-stimulated MSC-derived exosomes in senile osteogenesis and osteoclast dialogue. J Nanobiotechnology. 2023 Sep 23;21(1):346.