Pipetty電動(dòng)移液器在新城疫檢測(cè)（RT-PCR）中的應(yīng)用_abio生物試劑品牌網(wǎng)
方案摘要：本方案聚焦 PIpetty 電動(dòng)移液器于新城疫 RT-PCR 檢測(cè)的應(yīng)用。通過(guò)其高精度移液，在樣本處理階段精準(zhǔn)轉(zhuǎn)移 RNA 模板，確保逆轉(zhuǎn)錄起始模板量穩(wěn)定；PCR 擴(kuò)增環(huán)節(jié)，憑借連續(xù)分液等多種模式，高效完成多試劑添加，精準(zhǔn)控制珍貴試劑用量，提升反應(yīng)特異性與靈敏性。此外，Pipetty整機(jī)重量不到75g，相比同類型移液器，可以有效減輕操作人員的手部疲勞，溫度傳感器保障移液精度不受環(huán)境干擾。相比手動(dòng)移液器操作，該移液器顯著提升檢測(cè)效率，降低誤差，為新城疫快速、準(zhǔn)確診斷提供可靠支持。
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
新城疫由新城疫病毒引發(fā)，RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)新城疫，先提取病毒 RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成 cDNA。再基于 DNA 半保留復(fù)制，通過(guò)高溫變性解旋雙鏈，低溫退火使引物與 cDNA 結(jié)合，適溫延伸由 DNA 聚合酶合成新鏈。經(jīng) 30 - 40 個(gè)循環(huán)，微量病毒核酸大量擴(kuò)增，最后用電泳、熒光定量等方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，出現(xiàn)特異性條帶或達(dá)熒光閾值，即表明樣本含新城疫病毒。?
二、?實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① PCR擴(kuò)增儀。
② 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。
③ Ⅱ級(jí)生物安全柜。
④ 電泳儀。
⑤ 電泳槽。
⑥ 紫外凝膠成像儀。
⑦ Pipetty電動(dòng)移液器1-250、5-1000、1-10ML量程。
1、試劑和材料
① RNA提取試劑 Trizol。也可用商品化RNA提取試劑盒，或其他等效RNA提取試劑和方法，如自動(dòng)化核酸提取儀和其他配套核酸抽提試劑進(jìn)行核酸提取。
② 三氯甲烷(氯仿)。
③ 異丙醇(分析純)。
④ 75%乙醇：用新開(kāi)啟的無(wú)水乙醇（分析純）和DEPC處理水按3:1配制而成，-20℃預(yù)冷。
⑤ RT-PCR相關(guān)試劑：可選擇商品化試劑盒。
⑥ 陽(yáng)性對(duì)照：滅活的新城疫強(qiáng)毒感染雞胚尿囊液。
⑦ 陰性對(duì)照：SPF雞胚尿囊液。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、取處理后的拭子樣品、組織樣品或尿囊液3000r/min離心5min，取200μL離心后的上清提取RNA。
2、病毒 RNA 提取
RNA提取應(yīng)保證無(wú)細(xì)菌及核酸污染，實(shí)驗(yàn)材料和容器應(yīng)經(jīng)過(guò)消毒處理并一次性使用。提取RNA時(shí)應(yīng)避免RNA酶污染。用Trizol提取核酸RNA的操作步驟如下:
a) 在無(wú)RNA酶的1.5 mL離心管中加入 200μL檢測(cè)樣品，然后加入1mL Trizol，振蕩20s，室溫靜置 10 min。
b)加入 200 μL三氯甲烷（氯仿），顛倒混勻，室溫靜置10 min，12000r/min離心 15 min。
c)管內(nèi)液體分為三層，取500μL上清液于離心管中，加入500μL預(yù)冷(-20℃)的異丙醇，顛倒混勻，靜置10min。12000r/min離心 15 min沉淀RNA，棄去所有液體（離心管在吸水紙上控干）。
d)加入700μL預(yù)冷（-20℃）的75%乙醇洗滌，顛倒混勻2次~3次。12000r/min 離心10 min。
e)調(diào)水浴至60℃。離心管在室溫下干燥至沒(méi)有水滴。加入40μL DEPC處理水，60℃水浴中作用10min，充分溶解RNA，-70℃保存或立即使用。
3、 配置RT-PCR反應(yīng)體系
引物針對(duì)新城疫病毒F基因設(shè)計(jì):
5、使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，按加樣順序全部加完并做三個(gè)復(fù)孔后，充分混勻，瞬時(shí)離心，使液體都沉降到PCR管底。同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。按照下列程序進(jìn)行擴(kuò)增：42℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性3min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共進(jìn)行 35次循環(huán)；最后，72℃再延伸7min。最終的 RT-PCR產(chǎn)物置4 ℃保存。
6、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)， 1.5%瓊脂糖凝膠板的制備：稱取1.5g瓊脂糖，加入100mL1×TAE緩沖液中。加熱融化后加5μL(10 mg/mL)溴乙錠，混勻后倒入放置在水平臺(tái)面上的凝膠盤(pán)中，膠板厚5mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔)，放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒(méi)膠面。
7、加樣：用Pipetty取5μLPCR產(chǎn)物與0.5μL 10×加樣緩沖液混勻后加入瓊脂糖凝膠板的一個(gè)加樣孔中每次電泳同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。
8、電泳：接通電源，120V恒壓電泳30 min~40 min。
9、電泳結(jié)束后，取出凝膠板置凝膠成像儀（或紫外線透射儀）上觀察并記錄結(jié)果。
五、結(jié)果判定
1、試驗(yàn)成立條件：陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)535bp左右擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶。
2、檢測(cè)樣品出現(xiàn)535bp左右的目的片段（與陽(yáng)性對(duì)照大小相符），判為新城疫病毒核酸陽(yáng)性；
3、檢測(cè)樣品未出現(xiàn)目的片段，判為新城疫病毒核酸陰性。
六、NDV強(qiáng)毒感染的確定
對(duì)擴(kuò)增到的目的片段進(jìn)行序列測(cè)定，根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果，對(duì)毒株F基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析。如果毒株F2蛋白的C端有“多個(gè)堿性氨基酸殘基”，F(xiàn)1蛋白的N端即117位為苯丙氨酸，可確定為新城疫病毒強(qiáng)毒感染。”多個(gè)堿性氨基酸“是指毒株F2蛋白的C端在113位到116位殘基之間至少有三個(gè)精氨酸或賴氨酸。
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
新城疫由新城疫病毒引發(fā)，RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)新城疫，先提取病毒 RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成 cDNA。再基于 DNA 半保留復(fù)制，通過(guò)高溫變性解旋雙鏈，低溫退火使引物與 cDNA 結(jié)合，適溫延伸由 DNA 聚合酶合成新鏈。經(jīng) 30 - 40 個(gè)循環(huán)，微量病毒核酸大量擴(kuò)增，最后用電泳、熒光定量等方法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，出現(xiàn)特異性條帶或達(dá)熒光閾值，即表明樣本含新城疫病毒。?
二、?實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① PCR擴(kuò)增儀。
② 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。
③ Ⅱ級(jí)生物安全柜。
④ 電泳儀。
⑤ 電泳槽。
⑥ 紫外凝膠成像儀。
⑦ Pipetty電動(dòng)移液器1-250、5-1000、1-10ML量程。
1、試劑和材料
① RNA提取試劑 Trizol。也可用商品化RNA提取試劑盒，或其他等效RNA提取試劑和方法，如自動(dòng)化核酸提取儀和其他配套核酸抽提試劑進(jìn)行核酸提取。
② 三氯甲烷(氯仿)。
③ 異丙醇(分析純)。
④ 75%乙醇：用新開(kāi)啟的無(wú)水乙醇（分析純）和DEPC處理水按3:1配制而成，-20℃預(yù)冷。
⑤ RT-PCR相關(guān)試劑：可選擇商品化試劑盒。
⑥ 陽(yáng)性對(duì)照：滅活的新城疫強(qiáng)毒感染雞胚尿囊液。
⑦ 陰性對(duì)照：SPF雞胚尿囊液。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、取處理后的拭子樣品、組織樣品或尿囊液3000r/min離心5min，取200μL離心后的上清提取RNA。
2、病毒 RNA 提取
RNA提取應(yīng)保證無(wú)細(xì)菌及核酸污染，實(shí)驗(yàn)材料和容器應(yīng)經(jīng)過(guò)消毒處理并一次性使用。提取RNA時(shí)應(yīng)避免RNA酶污染。用Trizol提取核酸RNA的操作步驟如下:
a) 在無(wú)RNA酶的1.5 mL離心管中加入 200μL檢測(cè)樣品，然后加入1mL Trizol，振蕩20s，室溫靜置 10 min。
b)加入 200 μL三氯甲烷（氯仿），顛倒混勻，室溫靜置10 min，12000r/min離心 15 min。
c)管內(nèi)液體分為三層，取500μL上清液于離心管中，加入500μL預(yù)冷(-20℃)的異丙醇，顛倒混勻，靜置10min。12000r/min離心 15 min沉淀RNA，棄去所有液體（離心管在吸水紙上控干）。
d)加入700μL預(yù)冷（-20℃）的75%乙醇洗滌，顛倒混勻2次~3次。12000r/min 離心10 min。
e)調(diào)水浴至60℃。離心管在室溫下干燥至沒(méi)有水滴。加入40μL DEPC處理水，60℃水浴中作用10min，充分溶解RNA，-70℃保存或立即使用。
3、 配置RT-PCR反應(yīng)體系
引物針對(duì)新城疫病毒F基因設(shè)計(jì):
- 上游引物P1的序列為5'-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3';
- 下游引物P2的序列為5'-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3';
- Y為兼并堿基(Y：C/T)。
5、使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，按加樣順序全部加完并做三個(gè)復(fù)孔后，充分混勻，瞬時(shí)離心，使液體都沉降到PCR管底。同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。按照下列程序進(jìn)行擴(kuò)增：42℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性3min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共進(jìn)行 35次循環(huán)；最后，72℃再延伸7min。最終的 RT-PCR產(chǎn)物置4 ℃保存。
6、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)， 1.5%瓊脂糖凝膠板的制備：稱取1.5g瓊脂糖，加入100mL1×TAE緩沖液中。加熱融化后加5μL(10 mg/mL)溴乙錠，混勻后倒入放置在水平臺(tái)面上的凝膠盤(pán)中，膠板厚5mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔)，放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液淹沒(méi)膠面。
7、加樣：用Pipetty取5μLPCR產(chǎn)物與0.5μL 10×加樣緩沖液混勻后加入瓊脂糖凝膠板的一個(gè)加樣孔中每次電泳同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。
8、電泳：接通電源，120V恒壓電泳30 min~40 min。
9、電泳結(jié)束后，取出凝膠板置凝膠成像儀（或紫外線透射儀）上觀察并記錄結(jié)果。
五、結(jié)果判定
1、試驗(yàn)成立條件：陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)535bp左右擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶。
2、檢測(cè)樣品出現(xiàn)535bp左右的目的片段（與陽(yáng)性對(duì)照大小相符），判為新城疫病毒核酸陽(yáng)性；
3、檢測(cè)樣品未出現(xiàn)目的片段，判為新城疫病毒核酸陰性。
六、NDV強(qiáng)毒感染的確定
對(duì)擴(kuò)增到的目的片段進(jìn)行序列測(cè)定，根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果，對(duì)毒株F基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析。如果毒株F2蛋白的C端有“多個(gè)堿性氨基酸殘基”，F(xiàn)1蛋白的N端即117位為苯丙氨酸，可確定為新城疫病毒強(qiáng)毒感染。”多個(gè)堿性氨基酸“是指毒株F2蛋白的C端在113位到116位殘基之間至少有三個(gè)精氨酸或賴氨酸。
