Int J Biol Macromol：DAP-seq助力揭示水稻抗病新機制_abio生物試劑品牌網
研究背景
水稻在生長過程中會遭受多種生物脅迫，其中稻瘟病、細菌性葉枯病和紋枯病是最具破壞性的三大病害，會造成全球范圍內的糧食減產。植物激素如茉莉酸（JA）等可介導復雜的信號網絡以激活水稻的免疫反應。MYC轉錄因子是JA信號的主要調節(jié)因子，而泛素化作為重要的蛋白質翻譯后修飾，在植物免疫中發(fā)揮關鍵作用。此前研究發(fā)現水稻RING型E3泛素連接酶OsBBI1可正向調控水稻對稻瘟病的抗性，但其作用機制尚不明確。
文獻解讀
2025年6月，浙江大學生物技術研究所宋鳳鳴團隊在《International Journal of Biological Macromolecules》發(fā)表了題為“Rice E3 ubiquitin ligase BLAST AND BTH-INDUCED 1 targets jasmonic acid signaling co-repressors to release Myelocytomatosis protein 2 for modulating immune responses agAInst blast fungus”的研究論文。本研究借助DAP-seq技術，深入探索了OsBBI1調控水稻免疫的分子網絡，揭示了其通過降解JA信號抑制因子、釋放關鍵轉錄因子的完整抗病通路。
技術路線
研究結果
研究團隊通過酵母雙雜交（Y2H）、雙熒光素酶互補（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、熒光素酶互補（LCI）等技術，發(fā)現OsBBI1能直接結合JA信號通路中的抑制蛋白OsJAZ6、OsJAZ7、OsJAZ8及OsNINJA1。體外泛素化實驗、幾丁質誘導的ROS爆發(fā)實驗和細胞降解實驗進一步證實，OsBBI1通過其RING結構域催化這些蛋白的泛素化修飾，并促使它們通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）降解。證實OsBBI1通過降解JA信號的抑制蛋白（OsJAZs和OsNINJA1），解除其對免疫反應的抑制。當稻瘟病菌入侵時，OsBBI1能快速清除這些抑制因子，激活免疫反應。
圖1. OsBBI1與OsJAZ6、OsJAZ7和OsJAZ8相互作用并使其泛素化。
圖2. OsBBI1介導OsJAZ6和OsJAZ7的降解。
圖3. OsJAZ6、OsJAZ7和OsJAZ8負調控水稻稻瘟病抗性及幾丁質觸發(fā)的免疫反應。
圖4. OsBBI1和OsJAZ6與OsNINJA1相互作用，且OsBBI1抑制OsJAZ6和OsNINJA1的負向免疫功能。
通過BiFC、GST pull down和亞細胞定位分析，證實OsJAZ6與OsMYC2、OsMYC3相互作用，且OsMYC2與OsMYC3可形成同型/異型二聚體，主要分布于細胞核中。利用CRISPR/Cas9 技術構建OsMYC2過表達株系和Osmyc3敲除突變體，結合稻瘟病菌接種實驗、RT-qPCR和DAB染色，發(fā)現過表達植株的病斑更少、更小，真菌生長也更少，相應的OsPBZ1和OsJAmyb的表達顯著上調，H?O?積累增強；而突變體株系則相反。這些結果表明，OsMYC2和OsMYC3通過促進病原體誘導的防御基因表達和活性氧（ROS）積累，正向調控水稻對稻瘟病菌的免疫反應。
圖5. OsBBI1、OsJAZ6和OsNINJA1與OsTPL、OsTPR2、OsMYC2及OsMYC3存在相互作用。
圖6. OsMYC2和OsMYC3對水稻稻瘟病抗性起正向調控作用。
為了進一步研究OsMYC2的調控機制，本研究利用DAP-seq技術分析了OsMYC2在全基因組的結合位點。在兩個獨立的生物學重復中分別獲得了5776個和3281個假定結合峰，其中2038個為重疊結合峰。通過生物信息學分析發(fā)現，30.3%的結合峰富集于基因啟動子區(qū)域，表明OsMYC2主要通過調控啟動子區(qū)域基因表達發(fā)揮功能。結合峰在水稻各染色體上呈非偏倚性分布，涉及1084個基因的啟動子，KEGG富集分析顯示，其顯著富集于次生代謝物生物合成、植物激素信號轉導、MAPK信號通路。結合ChIP-PCR、EMSA和熒光素酶報告基因實驗，證實OsMYC2可通過結合OsGST、OsOXO3、OsOXO4、OsZIP9等防御基因啟動子中的G-box元件，直接調控其轉錄表達。結果表明OsMYC2是連接OsBBI1與下游免疫反應的核心樞紐。當OsJAZs被降解后，OsMYC2進入細胞核，與OsMYC3聯手啟動抗氧化酶、金屬轉運蛋白等基因的表達，增強水稻對病菌的抵抗能力。
圖7. OsMYC2通過結合啟動子中的G-box元件調控OsGST、OsOXO3、OsOXO4和OsZIP9的表達。
該研究突破了傳統(tǒng)對JA信號調控的認知，構建了“OsBBI1→降解JA抑制因子→釋放OsMYC2→激活防御基因”的完整調控鏈，證實E3泛素連接酶可通過“降解抑制因子”的方式快速激活免疫，為作物抗病機制研究提供了新思路。
圖 8. OsMYC2激活OsOXO4和OsZIP9的轉錄，并提出OsBBI1-OsJAZ6-OsMYC2模塊在水稻免疫中功能的工作模型。
水稻在生長過程中會遭受多種生物脅迫，其中稻瘟病、細菌性葉枯病和紋枯病是最具破壞性的三大病害，會造成全球范圍內的糧食減產。植物激素如茉莉酸（JA）等可介導復雜的信號網絡以激活水稻的免疫反應。MYC轉錄因子是JA信號的主要調節(jié)因子，而泛素化作為重要的蛋白質翻譯后修飾，在植物免疫中發(fā)揮關鍵作用。此前研究發(fā)現水稻RING型E3泛素連接酶OsBBI1可正向調控水稻對稻瘟病的抗性，但其作用機制尚不明確。
文獻解讀
2025年6月，浙江大學生物技術研究所宋鳳鳴團隊在《International Journal of Biological Macromolecules》發(fā)表了題為“Rice E3 ubiquitin ligase BLAST AND BTH-INDUCED 1 targets jasmonic acid signaling co-repressors to release Myelocytomatosis protein 2 for modulating immune responses agAInst blast fungus”的研究論文。本研究借助DAP-seq技術，深入探索了OsBBI1調控水稻免疫的分子網絡，揭示了其通過降解JA信號抑制因子、釋放關鍵轉錄因子的完整抗病通路。
技術路線
研究結果研究團隊通過酵母雙雜交（Y2H）、雙熒光素酶互補（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、熒光素酶互補（LCI）等技術，發(fā)現OsBBI1能直接結合JA信號通路中的抑制蛋白OsJAZ6、OsJAZ7、OsJAZ8及OsNINJA1。體外泛素化實驗、幾丁質誘導的ROS爆發(fā)實驗和細胞降解實驗進一步證實，OsBBI1通過其RING結構域催化這些蛋白的泛素化修飾，并促使它們通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）降解。證實OsBBI1通過降解JA信號的抑制蛋白（OsJAZs和OsNINJA1），解除其對免疫反應的抑制。當稻瘟病菌入侵時，OsBBI1能快速清除這些抑制因子，激活免疫反應。
圖1. OsBBI1與OsJAZ6、OsJAZ7和OsJAZ8相互作用并使其泛素化。
圖2. OsBBI1介導OsJAZ6和OsJAZ7的降解。
圖3. OsJAZ6、OsJAZ7和OsJAZ8負調控水稻稻瘟病抗性及幾丁質觸發(fā)的免疫反應。
圖4. OsBBI1和OsJAZ6與OsNINJA1相互作用，且OsBBI1抑制OsJAZ6和OsNINJA1的負向免疫功能。
通過BiFC、GST pull down和亞細胞定位分析，證實OsJAZ6與OsMYC2、OsMYC3相互作用，且OsMYC2與OsMYC3可形成同型/異型二聚體，主要分布于細胞核中。利用CRISPR/Cas9 技術構建OsMYC2過表達株系和Osmyc3敲除突變體，結合稻瘟病菌接種實驗、RT-qPCR和DAB染色，發(fā)現過表達植株的病斑更少、更小，真菌生長也更少，相應的OsPBZ1和OsJAmyb的表達顯著上調，H?O?積累增強；而突變體株系則相反。這些結果表明，OsMYC2和OsMYC3通過促進病原體誘導的防御基因表達和活性氧（ROS）積累，正向調控水稻對稻瘟病菌的免疫反應。
圖5. OsBBI1、OsJAZ6和OsNINJA1與OsTPL、OsTPR2、OsMYC2及OsMYC3存在相互作用。
圖6. OsMYC2和OsMYC3對水稻稻瘟病抗性起正向調控作用。
為了進一步研究OsMYC2的調控機制，本研究利用DAP-seq技術分析了OsMYC2在全基因組的結合位點。在兩個獨立的生物學重復中分別獲得了5776個和3281個假定結合峰，其中2038個為重疊結合峰。通過生物信息學分析發(fā)現，30.3%的結合峰富集于基因啟動子區(qū)域，表明OsMYC2主要通過調控啟動子區(qū)域基因表達發(fā)揮功能。結合峰在水稻各染色體上呈非偏倚性分布，涉及1084個基因的啟動子，KEGG富集分析顯示，其顯著富集于次生代謝物生物合成、植物激素信號轉導、MAPK信號通路。結合ChIP-PCR、EMSA和熒光素酶報告基因實驗，證實OsMYC2可通過結合OsGST、OsOXO3、OsOXO4、OsZIP9等防御基因啟動子中的G-box元件，直接調控其轉錄表達。結果表明OsMYC2是連接OsBBI1與下游免疫反應的核心樞紐。當OsJAZs被降解后，OsMYC2進入細胞核，與OsMYC3聯手啟動抗氧化酶、金屬轉運蛋白等基因的表達，增強水稻對病菌的抵抗能力。
圖7. OsMYC2通過結合啟動子中的G-box元件調控OsGST、OsOXO3、OsOXO4和OsZIP9的表達。
該研究突破了傳統(tǒng)對JA信號調控的認知，構建了“OsBBI1→降解JA抑制因子→釋放OsMYC2→激活防御基因”的完整調控鏈，證實E3泛素連接酶可通過“降解抑制因子”的方式快速激活免疫，為作物抗病機制研究提供了新思路。
圖 8. OsMYC2激活OsOXO4和OsZIP9的轉錄，并提出OsBBI1-OsJAZ6-OsMYC2模塊在水稻免疫中功能的工作模型。 
