背景
熒光成像技術，包括單光子（1P）、雙光子（2P）和三光子（3P）顯微鏡技術，極大地推動了神經科學的發展。特別是微型化熒光顯微鏡的出現，開啟了自由活動動物中神經元結構和活動觀察的新范式。得益于單光子激發的高效率，微型化單光子顯微鏡（m1PM）能夠使用LED光源實現數毫米范圍的照明及相應的成像視場（FOV）。然而，由于缺乏光學切片能力，m1PM的體內成像的分辨率有限，無法觀察樹突棘等精細結構。 雙光子成像技術 具有固有的光學切片能力和深層組織穿透能力，其中微型化 雙光子顯微鏡 （m2PM）已實現在自由活動小鼠大腦中對神經元突觸的成像。該技術進一步發展將成像視場擴大至1×0.8mm ² ，實現了同步三色成像，并達到854μm的成像深度。此外，微型化三光子顯微鏡（m3PM）利用三光子效應，使成像深度突破1mm。

微型化多光子顯微鏡在自由活動動物成像中扮演著日益重要的角色，然而，其實踐應用仍面臨諸多挑戰。多光子顯微鏡優異的光學切片能力導致其景深較淺（3至20μm，由軸向分辨率確定），成像視野通常在1mm²以內。在缺乏引導的情況下，要在跨越數毫米顱窗或梯度變折射率透鏡（GRIN Lens）的三維空間中，快速定位目標感興趣區域（ROI）仍具挑戰性。尤其是對于缺乏經驗的研究者而言，確認ROI并將微型化顯微鏡安裝到小鼠頭部可能耗費數十分鐘甚至數小時，這極大限制了該技術在自由活動動物研究中的進一步應用。

為解決這一問題，開發團隊在早期的工作中將寬場（WF）物鏡與m2PM頭戴式裝置的微型化物鏡（FHIRM-TPM）相結合，創建了用于定位的寬視場熒光成像裝置。然而，由于早期的微型化物鏡的視場有限（約150μm），在幾毫米寬的顱窗內仍難以快速找尋感興趣區域。此外，在切換至m2PM成像時，由于寬視場物鏡的工作距離有限（約37.5mm），需要對光纖進行較大的彎曲，這使得操作更具挑戰性。近期，Zong等人引入了旋轉臺來固定m2PM頭戴裝置，通過角度調整實現與某些特定的腦區更好的對準。盡管取得這些進展，但在三維腦組織中快速定位感興趣區仍存在挑戰，給新研究人員帶來了陡峭的學習曲線。此外，當前m2/3PM的工作距離小于2mm，當使用z軸平臺定位焦平面時，樣本或物鏡極易受損，對經驗不足的用戶尤為明顯。總的來說，亟需開發一種具有增強引導功能的多模態成像平臺，并建立標準化工作流程，以實現對自由活動動物的高效成像。

多模態熒光成像平臺的系統設計
為解決這一問題，開發團隊設計了多模態熒光成像平臺，將寬場熒光導航系統（WF-Nav）與微型化雙光子顯微成像和微型化三光子顯微成像進行了整合。為充分發揮單光子激發的優勢，WF-Nav系統配備了大視場和單細胞分辨率功能，可快速識別指定感興趣區域。一旦定位到目標區域，系統可無縫切換至雙光子或三光子成像，進一步實現高信噪比或深層神經元成像。隨后將m2PM或m3PM探頭固定于小鼠頭部，釋放小鼠進行自由活動成像。

圖1.多模態熒光成像系統設計

寬場熒光導航系統設計
WF-Nav系統由一臺多色大視場寬場顯微鏡和多功能適配器組成。該系統采用三個LED作為激發光源（405nm，473nm，561nm），并配備高數值孔徑的非球面聚光透鏡對LED光束進行準直，每個激發光路均配有相應的濾光片組。為實現大視場導航并為無縫切換多光子鏡組提供充足空間，開發團隊設計了一款長工作距離、低倍率的干式物鏡。該物鏡（3.3x）采用反遠攝設計：前組為兩片膠合雙合透鏡提供負光焦度，后組由單片球面透鏡構成。這種結構將主平面后移以校正色差，在保持數值孔徑的同時實現了超長有效焦距的工作距離，最終達成90mm工作距離的突破性指標，并實現了Φ5.64mm的最大成像視場。

圖2.寬場熒光顯微鏡設計

為實現寬場模式與多光子成像模式間的無縫切換，該團隊設計了一款多功能適配器。該適配器連接寬場物鏡，并在Z軸電動平臺上進行焦距調節。通過標準化的m2/3PM探頭設計，探頭可穩固的安裝在同一支架上，并保證了多光子與寬場模式切換時的齊焦成像。

圖3.多功能適配器與齊焦功能

此款90mm工作距離的物鏡為操作頭件、光纖或加裝可拆卸電動變焦透鏡模塊提供了充足空間。頭件支架安裝在滑動阻力極小（約0.1N）、伸縮距離12 mm的輕型直線滾珠滑軌上，可有效避免物鏡與樣本的碰撞風險。通過更換頭件支架，系統可兼容不同頭件，如mini2P和m3PM。此外，得益于微型化化雙光子顯微鏡的尺寸與可回縮設計，相較于常規臺式物鏡，該系統在大多數方向上提供了更大的觀察角度，從而帶來了更廣的樣本觀察范圍。這一設計顯著提升了樣本的粗定位效率。

圖4.不同物鏡與微型化雙光子顯微鏡觀察角的對比

接下來，開發人員評估了寬場熒光顯微鏡的光學性能與實際應用。對Thy1-YFPH小鼠的腦切片進行成像，可以清晰識別出神經元和軸突。在470nm波長下進行活體鈣離子成像，561nm波長下進行形態學成像，成功捕獲了3804個GCaMP6f標記的神經元以及4650個表達mCherry的小鼠星形膠質細胞。這些結果證明了該寬場顯微鏡具備多色、單細胞分辨率和高通量成像能力，并提供了對感興趣目標區域導航的出色性能。

圖5.微型化寬場顯微鏡高通量成像

標準化微型多光子顯微成像流程建立
為了讓自由活動小鼠中的m2PM成像工作更加順暢，開發人員建立了一套標準化成像流程，以提高自由活動動物中m2PM成像的效率。首先對動物進行病毒注射和外科手術操作，如顱窗植入或GRIN Lens植入，隨后等待2-4周確保病毒充分表達及手術損傷恢復。以某次實驗為例，我們在初級運動皮層（M1）神經元中標記了GCaMP6s和mCherry，隨后將小鼠固定于WF-Nav裝置下的跑步機上。接著通過寬場顯微鏡定位目標感興趣區域并將其對準視野中心。隨后通過適配器切換至m2PM模式，在920nm和1030nm波長下進行雙色雙光子成像，最后對XY軸和焦平面進行精細調整，可以在幾分鐘內確認最終的目標區域。大多數情況下，會將目標焦平面抬高約25μm，以補償水泥收縮導致的焦點偏移，再將Baseplate固定在動物頭部的頭件上，經過約10分鐘的固化后，小鼠即可進行自由活動成像。

圖6.標準化自由活動微型雙光子顯微成像流程

開發人員通過小鼠社交實驗中對神經元的鈣信號和結構進行成像，驗證了該系統，整個安裝操作過程耗時約20分鐘，成功率高達100%（n=15），即使是沒有經驗的研究人員也能輕松掌握，從而極大提高了實驗效率。此外，對M1區第2層神經元和星形膠質細胞進行了多天重復成像，結果顯示在不重新安裝Baseplate的情況下，視野配準穩定。 圖7.多天相同視野成像        
得益于標準化的機械設計，m3PM成像頭能夠便捷地安裝在支架上。應用多功能適配器，可實現從寬場模式到三光子成像模式的無縫切換。由于寬場單光子顯微鏡成像深度存在局限，深層信號往往難以探測；雖然淺表血管可作為一定參考，但保留表層的病毒注射區域能提供更直接的熒光標記，有助于在垂直軸上對準更深部位。開發人員在頭部固定、表達GCaMP6f的小鼠中，成功從皮層表面記錄到深達1020μm的postsubiculum區神經活動，并進行小鼠曠場行為探索實驗，在670μm深度處記錄長時間鈣信號活動。
  圖8.微型化三光子固定與自由行為成像
該工作由北京信息科技大學吳潤龍教授（通訊作者）、北京大學王愛民、程和平教授等人完成。

【參考文獻】
Wu R, Sun Y, Hao Z, et al. Wide-field fluorescence navigation system for efficient miniature multiphoton imaging in freely behaving animals. Neurophotonics. 2025;12(2):025018. doi:10.1117/1.NPh.12.2.025018

超維景將把寬場導航系統應用于其推出的微型化多光子 SUPERNOVA全系產品，包括SUPERNOVA-100、SUPERNOVA-600、SUPERNOVA-3000、SUPERNOVA-SMART 等。使所有微型化多光子顯微鏡用戶在實際成像過程中，能夠實現更便捷、更安全、更高效的操作體驗。

SUPERNOVA全系產品

一體式微型化雙光子顯微成像系統
SUPERNOVA-100

 

集成式微型化雙光子顯微成像系統
SUPERNOVA-600

 

微型化雙光子顯微鏡(mTPM)
SUPERNOVA-SMART

 

微型化三光子顯微成像系統
SUPERNOVA-3000