在細胞外囊泡（EVs）的眾多來源中，牛奶來源的細胞外囊泡（milk-derived extracellular vesicles, mEVs）因其來源豐富、具有天然的生物活性和生物相容性等特性，被視為有潛力的下一代治療遞送平臺。mEVs 被開發用于口服藥物遞送的載體，保護治療藥物免受胃腸道降解，改善腫瘤的靶向治療。然而，要充分挖掘 mEVs 的治療潛力，需深入探究其細胞攝取行為及在細胞內的轉運過程，這需要依賴可靠的標記技術。目前，常用的熒光標記方法存在諸多問題：例如，親脂性染料標記存在染料脫落、自聚集、轉移以及影響囊泡完整性等問題；常用的共價標記技術，如N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide, NHS）酯染料標記，需要借助蛋白表面的伯胺，可能會改變囊泡表面蛋白的功能；基因工程標記則不適用于非培養來源的囊泡（如 mEVs），在實際應用中受到限制。因此，開發一種簡單、穩定且對囊泡結構和功能影響較小的標記方法顯得尤為關鍵。

日前，集美大學陳超翔教授團隊在 Small Methods 發表題為“Glycan-Anchored Fluorescence Labeling of Milk-Derived Extracellular Vesicles for Investigating Their Cellular Uptake and Intracellular Fate”的文章，報道了一種“聚糖錨定”熒光標記策略。該策略通過氧化 mEVs 表面的唾液酸殘基，與熒光染料共價連接，從而實現對 mEVs 的高效標記。經納米流式（NanoFCM）分析證實該方法的標記效率近 100%，且 mEVs 的完整性和生物功能不受影響。這一創新的標記技術為深入研究 mEVs 的細胞攝取、細胞內轉運機制以及藥物遞送效率提供了有力的支持，有望推動基于 mEVs 的新型藥物遞送系統的研發和臨床應用。

01 聚糖錨定熒光標記策略
研究者通過高碘酸鹽氧化 mEVs 表面的唾液酸產生醛基，再經苯胺催化與含酰肼功能化的熒光團（Cy5-酰肼）進行共價結合，實現熒光標記（圖1a）。然后，利用 NanoFCM 對標記后的 mEVs 進行分析，熒光檢測顯示約 100% 的 mEVs 成功標記了 Cy5，證實該方法具有極高的標記效率（圖1c, d）。同時，研究發現該標記不影響 mEVs 的物理性質、蛋白標志物和細胞攝取能力，且在不同溫度和 pH 條件下穩定性良好，對多種來源的 EVs 均適用（圖2）。
 

圖1. NanoFCM 評估聚糖錨定熒光標記 mEVs 的效率

圖2. 聚糖錨定熒光標記不同來源 EVs 的效率
02  與親脂性標記方法的對比
研究者利用 NanoFCM 對聚糖錨熒光標記方法與親脂染料標記方法從標記效率、穩定性以及對囊泡特性的影響進行系統比較。結果顯示，聚糖錨定標記法在所有測試的 mEVs 濃度下，均展現出近乎 100% 的標記效率，且不會引發囊泡的聚集或裂解（圖3a-d），充分顯示出該方法的高效性與穩定性。而親脂性染料（如 DiD、PKH67、DiO）的標記效果則因濃度依賴性導致結果不穩定，低濃度時標記效率不足，高濃度則導致 mEVs 聚集、裂解和染料自聚集（圖3）。   圖3. 通過 NanoFCM 比較聚糖錨定標記與親脂性熒光標記
03  mEVs 的細胞攝取和胞內轉運
研究者將 mEVs-Cy5 與 MCF-7 細胞共同孵育，通過流式細胞術（FCM）檢測發現，隨著孵育時間的延長，細胞的熒光強度在 8 小時達到峰值，隨后略有下降，表明 mEVs 攝取存在飽和狀態（圖4b, c）。此外，研究發現細胞的熒光強度與 Cy5 標記密度呈嚴格的線性關系，這充分說明標記過程并未影響 mEVs 的細胞攝取能力（圖4d）。進一步，通過 NanoFCM 對細胞培養基中 mEVs-Cy5 的濃度變化進行準確定量。結果顯示，與 MCF-7 細胞共孵育后，mEVs-Cy5 的濃度顯著降低，證實細胞成功攝取了 mEVs。經基于濃度變化的計算，每個 MCF-7 細胞平均攝取了約 2938 個 mEVs（圖4h）。   圖4. mEVs 細胞攝取的定量分析
通過抑制劑實驗，研究者進一步分析了 mEVs 在細胞內的轉運路徑，并確定其進入細胞主要通過網格蛋白介導的內吞和巨胞飲作用。此外，通過共聚焦激光熒光顯微鏡觀察，發現 mEVs 最初與溶酶體共定位，但 24 小時后部分 mEVs 成功從溶酶體中逃逸（圖5a-g）。上述發現揭示了 mEVs 在細胞內的轉運特征，為其在細胞質中釋放藥物提供了潛在的作用機制和理論依據。   圖5. mEVs 的細胞攝取途徑和細胞內運輸的研究
04  藥物遞送和細胞毒性
為了評估 mEVs 作為藥物遞送載體的潛力，研究者將化療藥物紫杉醇（FITC標記，PTX-FITC）裝載至 mEVs 中，并利用新方法實現雙重標記（Cy5標記mEVs，FITC標記藥物）。通過 NanoFCM 分析，發現約 90% 的 mEVs 成功裝載了 PTX-FITC，進一步的共標記實驗表明，裝載了 PTX 藥物的 mEVs 均標記上了 Cy5，雙陽性比例高達 86.6%。相比之下，傳統親脂性染料 DiD 標記顯著減弱了 mEVs 載藥的能力（圖6b-d）。綜上結果表明，mEVs 具備高效裝載藥物的能力，且聚糖錨定標記不影響 mEVs 的載藥能力。

進一步通過 FCM 實時跟蹤細胞攝取過程，結果顯示，細胞內 Cy5 熒光強度在 8 小時達到峰值，而 FITC 熒光強度在 24 小時后顯著增加。此外，利用 FITC 的 pH 敏感熒光特性，研究者觀察到其熒光信號的變化，證實了 mEVs 能夠逃離溶酶體，并將攜帶的藥物以“爆發式”方式釋放至細胞質中（圖6f-h）。癌細胞毒性實驗也顯示，mEVs-PTX-FITC 在作用 24 小時后顯示出顯著的細胞毒性（圖6i），這一結果證明，mEVs 能夠有效地將藥物遞送到細胞內，并發揮治療效果。   圖6. mEVs 的載藥能力和細胞毒性分析
總 結
本研究通過開發基于聚糖錨定的熒光標記技術，克服傳統標記方法的局限性，實現了對 mEVs 的高效、穩定標記。此種標記方法不會損害 mEVs 的完整性或攝取行為，也不會誘導囊泡聚集或染料泄漏，其綜合表現顯著優于傳統的膜染料。已有數據表明，基于聚糖錨定的熒光標記技術具有廣泛的適用性，已在多種來源的 EVs 中成功實現。此外，本研究還評估了 mEVs 作為藥物遞送載體的潛力，裝載了紫杉醇的 mEVs 在癌細胞內展現出顯著的殺傷作用，有力證實了其作為藥物遞送載體的潛力。該技術不僅為 EVs 的細胞攝取和藥物遞送機制提供了重要理論依據，還為基于 EVs 的靶向藥物遞送進一步研究和應用鋪平了道路。