Overexpression of pressure-responsive miRNA-5703 inhibits pressure-induced growth and metastasis of liver cancer

Keywords: liver cancer; metastasis; miRNA-5703; portal hypertension; pressure; proliferation.

肝癌是全球癌癥相關死亡第三大原因，男女死亡率合計 8.2% 。免疫抑制劑治療肝癌反應率低，腫瘤微環境是關鍵干擾因素，其中物理線索作用未明。門靜脈高壓癥（PHTN）是肝癌公認危險因素與獨立預測因子，會增加肝竇生物壓力，破壞腫瘤微環境機械平衡，但其調節肝癌細胞增殖和轉移機制不明。壓力影響實體瘤生長侵襲，此前研究心血管和骨科疾病中機械響應 miRNAs ，肝癌中壓力反應 miRNA 功能待探索。SRC 自磷酸化等信號通路與癌癥進展轉移相關。前期研究發現 15 mmHg 壓力作用 24 小時可促進肝癌細胞系增殖、遷移和侵襲，篩選出相關 miRNAs 和mRNA 。基于此，南京大學金陵醫院消化內肝病科的研究團隊通過體內外實驗探究壓力反應 miRNA - 5703 在肝癌生長和轉移中的作用及機制，發現其過表達或抑制肝癌機械依賴性發展，為其與免疫抑制劑聯合應用提供理論基礎。研究成果發表在Journal of Cancer 期刊，題為“Overexpression of pressure-responsive miRNA-5703 inhibits pressure-induced growth and metastasis of liver cancer”。


首先，使用 MicroDB、MicroTarBase 和 TargetScan 三個網站，對通過 miRNA 微陣列鑒定出的五個壓力敏感型 miRNA（miRNA-5703、miRNA-630、miRNA-7641、miRNA-7-5p 和 miRNA-4485-3p）的靶基因進行預測，分別得到 1213、10679 和 1222 個靶基因（圖 1A）。綜合共 11526 個基因，其中 1309 個與通過 mRNA 微陣列鑒定出的差異表達 mRNA 相對應（圖 1B），且差異表達的預測靶基因中有 SRC 基因。

對這 1309 個靶基因進行 KEGG 通路分析，發現與癌癥生長和轉移相關的前三條通路為FA通路、PI3K 通路和 FOXO 通路（圖 1C），且這三條通路共同上游基因為 SRC，也是在壓力負荷下表達下調的 miRNA-5703 的預測靶基因之一。

使用 mRNA 微陣列檢測對照組（培養 24 小時的 HepG2 細胞）和壓力處理組（15 mmHg 壓力下處理 24 小時的細胞）的變化，得到與三條通路相關的差異表達基因聚類熱圖（圖 1D），顯示 PTK2、PI3K、PIK3R1、SRC 和 SGK3 在受壓肝癌細胞中表達上調，FOXO1、CDKN1B、P27Kip1 表達下調，PDK1 表達無顯著變化，且通過 RT-qPCR 在 HepG2 和 Huh-7 細胞系中驗證了這些基因表達（P < 0.05 或 P < 0.01） 。
 

圖1 壓力誘導信號通路的預測。

隨后，通過 miRNA 芯片和 mRNA 微陣列檢測發現，受壓 HepG2 細胞中 miRNA - 5703 表達下調約 0.68 倍（圖 1F），SRC 表達上調約 8.87 倍（圖 1G）。利用 RT - qPCR 在 HepG2、Huh - 7 和 MHCC97H 三種肝癌細胞系中驗證了該芯片結果（圖 2A，P <0.05，P < 0.01 或 P < 0.001；圖 2B，P < 0.05），而在正常肝細胞系 HL - 7702 中，miRNA - 5703 和 SRC 的表達無顯著變化（圖 2A，P> 0.05；圖 2B，P > 0.05）。

Western blotting 表明，miRNA - 5703 過表達可抑制 HepG2 和 Huh - 7 細胞中 SRC 的表達（圖 2C 和 2D，P <0.05）。利用 TargetScan 網站預測出 miRNA - 5703 在 SRC 3' 非翻譯區第 1745 - 1751 位核苷酸的 7mer - m8 型結合位點（圖 2E）。通過將野生型和突變型質粒轉染至 HEK293T 細胞并檢測熒光素酶信號比值，在 SRC 中野生型結合位點的 miRNA - 5703 過表達后，該比值降低了 43.69%（圖 2F，P < 0.001），而結合位點突變后 miRNA - 5703 過表達前后該比值沒有顯著差異（圖 2F，P> 0.05）。

研究收集不同巴塞羅那臨床肝癌分期（BCLC）患者的肝癌及癌旁正常組織樣本，對比發現：與 BCLC A1 期（無門靜脈高壓，PHTN）患者相比，A2 - D 期（有門靜脈高壓）患者的肝癌組織中，miR - 5703 表達被抑制（圖2G，P <0.05），SRC 的 mRNA 水平更高（圖2I，P < 0.05） ，且這一差異在癌旁正常組織中不顯著（圖 2H和2J,P > 0.05)。進一步分析配對組織發現，A1 期和 A2 - D 期多數患者的肝癌組織中 SRC 表達高于癌旁正常組織，其中相當比例患者肝癌組織的 SRC 呈高表達（> 2 倍）（圖2K和2L）。

 圖2 驗證 SRC 作為 miRNA-5703 的靶基因。

為了研究 HepG2 和 Huh-7 細胞系的增殖情況，采用流式細胞術進行檢測檢測。結果發現，miRNA-5703 過表達顯著降低 HepG2 和 Huh-7 細胞處于 S 期的比例，敲低 SRC 也有類似效果。將 HepG2 和 Huh-7 細胞分組處理后，CCK-8 法檢測顯示，miRNA-5703 過表達及敲低 SRC 均能顯著抑制肝癌細胞增殖，而對于受壓的正常肝細胞系 HL-7702 細胞，其生長不受影響（圖3）。

圖3 miRNA-5703 的過表達抑制了壓力誘導的肝癌細胞增殖。

研究壓力對SRC-FAK-FOXO1 信號通路誘導細胞增殖的影響。結果發現15 mmHg壓力負荷促進肝癌細胞中 SRC、FAK、PI3K、SGK3 表達，抑制 FOXO1 和 P27Kip1 表達（圖4）。且使 pSRC、pFAK、pPDK1、pSGK3 表達上調，說明壓力不僅 在mRNA 水平上增加影響相關基因轉錄，還激活蛋白磷酸化，同時 PDK1 的 mRNA 表達不受壓力調控但蛋白可被磷酸化。對受壓細胞分別用赫比霉素 A（pSRC 抑制劑）、Gsk2256098（pFAK 抑制劑）、LY294002（PI3K 抑制劑）、PHT-427（PDK1 抑制劑）和 EMD638683（SGK3 抑制劑）進行處理并檢測級聯反應中上下游蛋白關系。此外，miRNA-5703 過表達或 SRC 敲低會抑制下游蛋白表達，揭示了 miRNA-5703 抑制腫瘤生長的機制（圖5）。

圖4 壓力通過 SRC-FAK-FOXO1 信號通路誘導細胞增殖。

圖5 miRNA-5703 的過表達以及 SRC 基因的沉默逆轉了壓力負荷在特定細胞中所誘導產生的增殖效應。

接下來，研究miRNA-5703 過表達對壓力誘導的肝癌細胞遷移和侵襲的影響。研究將 HepG2 和 Huh-7 細胞系依條件分為對照組、壓力組、壓力 + miRNA-5703（+）組、壓力 + SRC（-）組。細胞劃痕實驗顯示，miRNA-5703 過表達和 SRC 基因敲低均能抑制 HepG2 和 Huh-7 細胞遷移（圖6A）；Transwell 小室實驗表明，miRNA-5703 過表達顯著抑制 HepG2 和 Huh-7 細胞侵襲，SRC 基因敲低對肝癌細胞增殖有類似抑制效果（圖6B），而壓力對 HL-7702 細胞遷移無顯著影響（圖6C）。

圖6 miRNA-5703 的過表達抑制了壓力誘導的肝癌細胞的遷移和侵襲。

外周膜蛋白 GM130 與高爾基體膜緊密相連，參與細胞極化和定向遷移調控。免疫熒光測定顯示，HepG2、Huh-7 和 HL-7702 細胞中 GM130 表達增加（圖7A)。細胞黏附實驗表明，壓力負荷下 HepG2、Huh-7 和 MHCC97H 細胞系黏附于基質的細胞數量顯著增多（圖7B)。

圖7 壓力負荷對肝癌及正常肝細胞黏附與 GM130 表達的影響。

通過幽靈鉛筆環肽染色發現，壓力增加 HepG2 和 Huh-7 細胞的細胞骨架微絲數量，而 miRNA-5703 過表達顯著減少其數量；免疫熒光顯示，壓力上調黏著斑蛋白紐蛋白表達，miRNA-5703 過表達則顯著抑制受壓細胞中紐蛋白的表達（圖8）。

圖8 miRNA-5703 對肝癌細胞微絲及黏著斑蛋白表達的調控。

15 mmHg壓力下，赫比霉素 A 和 GSK2256098 抑制 HepG2 和 Huh-7 細胞中 paxillin 表達，另三種抑制劑無顯著影響， 這表明 15 mmHg的壓力負荷促進了 HepG2 和 Huh-7 細胞中 SRC 和 FAK 的表達，并且顯著上調了 paxillin 的表達。miRNA-5703 過表達或 SRC 敲低可抑制paxillin 表達，表明這可能是 miRNA-5703 抑制腫瘤轉移的機制（圖9）。

圖9 miRNA-5703 的過表達通過 SRC-paxillin 通路抑制壓力誘導的細胞增殖。

最后，實驗將 MHCC97H 細胞依條件分四組：對照組、壓力組、壓力 + 載體組、壓力 + miRNA-5703（+），將這些細胞皮下注射到小鼠后 10 天成像顯示，受壓細胞組腫瘤大小和重量增加，miRNA-5703 過表達組減小（圖 10A）；肝癌和正常肝組織 HE 染色如圖 10B；蛋白免疫印跡表明，miRNA-5703 過表達組中，壓力上調的 SRC 表達受抑制（圖10C）。
 

圖10 在裸鼠中驗證了壓力對肝癌生長和轉移的影響。

免疫組化檢測表明，壓力處理組腫瘤中 Ki67 表達上調、NM23 表達下調，miRNA - 5703 過表達組則相反（圖10D）。Ki67 與細胞增殖和有絲分裂相關，NM23 可抑制腫瘤轉移，兩者在臨床腫瘤檢測中意義重大。通過 RT - qPCR 評估四組腫瘤中 miRNA - 5703 表達（圖10E），級聯反應示意圖11所示。

圖11 壓力響應性 miRNA-5703 通過抑制 SRC 表達來促進肝癌生長和轉移的示意圖。

總之，該研究表明miRNA-5703 的上調通過抑制 SRC-FAK-FOXO1 軸和 SRC-paxillin 軸來抑制壓力誘導的肝癌生長和轉移 ，有助于研發受力學啟發的肝癌抗癌藥物。

參考文獻：Shen S, Zhou W, Xuan J, Xu W, Xu H, Yang M, Zhu L, Yang Z, Yang B, Shi B, Zhao Y, Wang F. Overexpression of pressure-responsive miRNA-5703 inhibits pressure-induced growth and metastasis of liver cancer. J Cancer. 2022 Jan 1;13(1):325-342. doi: 10.7150/jca.64926. PMID: 34976193; PMCID: PMC8692678.

原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8692678/

Impact Factor: 3.3

ISSN: 1837-9664

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