上期講述的單重組酶報告基因系統(tǒng)只能依賴一個 Maker 來定位我們的目的細(xì)胞，如果沒有特定細(xì)胞類型特有的基因，則無法通過常規(guī)方法對其進行特異性標(biāo)記。

往期推文：
【譜系示蹤系列第一期】基礎(chǔ)細(xì)胞標(biāo)記方式
【譜系示蹤系列第二期】單重組酶介導(dǎo)的多色報告系統(tǒng)方法

但隨著細(xì)胞分類的不斷深入，我們往往需要兩個甚至兩個以上的 Maker 才能準(zhǔn)確定位我們想要研究的細(xì)胞群體，并且在一個細(xì)胞群中靶向兩個基因啟動子可能比依賴傳統(tǒng)報告系統(tǒng)中常用的單個啟動子更精確。這時標(biāo)記細(xì)胞就需要使用到多重組酶介導(dǎo)的遺傳方法。

控制由兩個啟動子驅(qū)動的受限制報告基因表達需要兩種不同的重組酶系統(tǒng)，例如 Cre-loxP、Flp-frt、Dre-rox 和 Nigri-nox 等。目前已經(jīng)開發(fā)了多種雙重組酶介導(dǎo)的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，以增強特異性和同時標(biāo)記的細(xì)胞類型數(shù)量，目前常見的可分為交叉報告基因類型、獨家報告基因類型和嵌套報告基因類型。

圖. 多重組酶介導(dǎo)的基因重組系統(tǒng)^[1]

本期鼠博士為大家講解多重組酶介導(dǎo)的交叉報告基因類型。

交叉報告基因系統(tǒng)
為了精確標(biāo)記一個細(xì)胞群，有時使用兩個細(xì)胞特異性 maker 來定義細(xì)胞群，例如細(xì)胞特異性 makerA 與細(xì)胞特異性 makerB 雙陽性的細(xì)胞（簡稱為A⁺B⁺ Cell）。如何使用合適的報告基因標(biāo)記系統(tǒng)，特異性標(biāo)記這類型細(xì)胞呢？這時就需要用到交叉報告基因系統(tǒng)。

交叉報告基因系統(tǒng)用于標(biāo)記兩個 maker 雙陽性的細(xì)胞類型，根據(jù)其標(biāo)記顏色也可分為單色報告系統(tǒng)與多色報告系統(tǒng)。

單色報告系統(tǒng)
交叉報告基因小鼠與細(xì)胞特異性 makerA 的 Cre 鼠、細(xì)胞特異性 makerB 的 Dre 鼠進行交配。得到的小鼠體內(nèi)的兩個 maker 雙陽性的細(xì)胞被標(biāo)記為單色，其他細(xì)胞不被標(biāo)記上顏色。
 

1 A^-B^- 細(xì)胞：
該系統(tǒng)按照啟動子的方向，遇到stop序列被終止表達，細(xì)胞未被染色。

2 A⁺B^- 細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達，Cre 酶會切除兩個 loxP 位點之間的序列（第一個 stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動子的方向，遇到第二個 stop 序列被終止表達，細(xì)胞未被染色。

3 A^-B⁺ 細(xì)胞：
makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（第二個 stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動子的方向，遇到第一個 stop 序列被終止表達，細(xì)胞未被染色。

4 A⁺B⁺ 細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達，Cre 酶會切除兩個 loxP 位點之間的序列（第一個 stop 序列被切除），makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（第二個 stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達紅色熒光 tdTomato。

因此，僅A⁺B⁺細(xì)胞可被標(biāo)記為紅色。

案例1
下圖中就是通過兩個細(xì)胞特異性標(biāo)記特異性標(biāo)記了細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞 （BASC）。BASC 是位于細(xì)支氣管肺泡管交界處的多能干細(xì)胞，它們共同表達細(xì)支氣管細(xì)胞標(biāo)志物 Scgb1a1（也稱為 CC10）和肺泡2型細(xì)胞標(biāo)志物 Sftpc。由于缺乏專門定義 BASCs 的單一最佳標(biāo)記基因，無法使用傳統(tǒng)的 Cre-loxP 介導(dǎo)的譜系追蹤方法追逐 BASCs 的分化命運，而通過雙標(biāo)志物就可以特異性地追蹤Scgb1a1⁺Sftpc⁺ BASC。

圖. 單色交叉報告基因系統(tǒng)^[1]
多色報告系統(tǒng)
為了通過使用其他顏色同時對多種細(xì)胞類型（細(xì)胞群及其亞群）進行遺傳標(biāo)記，交叉遺傳報告基因系統(tǒng)會結(jié)合兩個或多個報告基因。

交叉報告基因小鼠與細(xì)胞特異性 makerA 的 Cre 鼠、細(xì)胞特異性 makerB 的 Dre 鼠進行交配。得到的小鼠體內(nèi)的 A⁺B^- 單陽性細(xì)胞、A^-B⁺ 單陽性細(xì)胞、A⁺B⁺ 雙陽性細(xì)胞被標(biāo)記為三種不同的顏色，其他細(xì)胞不被標(biāo)記上顏色。
 

1 A^-B^- 細(xì)胞：
該系統(tǒng)按照啟動子的方向，遇到 stop 序列被終止表達，細(xì)胞未被染色。

2 A⁺B^- 細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達，Cre 酶會切除兩個 loxP 位點之間的序列（第一個 stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照第一個啟動子的方向，表達紅色熒光 tdTomato。

3 A^-B⁺ 細(xì)胞：
makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（第二個 stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照第二個啟動子的方向，表達綠色熒光 zsGreen。

4 A⁺B⁺ 細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達，Cre 酶會切除兩個 loxP 位點之間的序列（第一個 stop 序列被切除），makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達，Dre 酶會切除兩個 Rox 位點之間的序列（第二個 stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動子的方向，表達紅色熒光 tdTomato 與綠色熒光 zsGreen，兩個蛋白的顏色重疊后，呈現(xiàn)出黃色熒光。

因此，A⁺B^- 細(xì)胞被標(biāo)記為紅色；A^-B⁺ 細(xì)胞被標(biāo)記為綠色；A⁺B⁺ 細(xì)胞可被標(biāo)記為黃色。

案例2
如下圖中，細(xì)支氣管細(xì)胞標(biāo)志物 Scgb1a1 陽性的細(xì)胞會被標(biāo)記為紅色，肺泡2型細(xì)胞標(biāo)志物 Sftpc 的細(xì)胞會被標(biāo)記成綠色，而雙陽性的細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞 （BASC）由于同時表達紅色與綠色熒光而被標(biāo)記為黃色。這樣可以通過不同的顏色準(zhǔn)確區(qū)分不同來源的細(xì)胞，增強對細(xì)胞群命運可塑性的理解。

圖. 多色交叉報告基因系統(tǒng)^[1]
上述講述的是多重組酶報告基因系統(tǒng)的交叉報告基因類型，主要用于標(biāo)記雙陽性的細(xì)胞類型，但其他類型的細(xì)胞應(yīng)該如何標(biāo)記呢？下一期鼠博士為大家講解多重組酶報告基因系統(tǒng)的獨家報告基因類型。

Reference：
[1] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapPIng studies. J Biol Chem. 2020 May 8;295(19):6413-6424. doi: 10.1074/jbc.REV120.011631. Epub 2020 Mar 25. PMID: 32213599; PMCID: PMC7212637.

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