《Nature》文獻分享：光片超分辨成像追蹤活細胞動態(tài)結構_abio生物試劑品牌網(wǎng)
光片熒光顯微術（LSFM）憑借高速三維成像和低光損傷特性，成為多細胞系統(tǒng)四維生物學成像的重要工具，但其光片厚度通常大于1微米，難以解析活細胞內(nèi)亞微米級精細結構。本文聚焦瑞典皇家理工學院研究團隊開發(fā)的多片層可逆飽和光學熒光躍遷顯微術（Multi-sheet RESOLFT），該技術通過可逆光開關熒光蛋白（RSFPs）與周期性光開關圖案的結合，首次實現(xiàn)了亞100納米級光片厚度的超分辨斷層成像，并以1–2Hz的高速完成三維體積采集，為動態(tài)追蹤細胞分裂、肌動蛋白運動及病毒樣顆粒行為提供了全新視角。
重要發(fā)現(xiàn)者為Andreas Bodén、Ilaria TESTA等，研究成果以《Super-sectioning with multi-sheet reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) microscopy》為題，發(fā)表在《Nature Methods》雜志。
重要發(fā)現(xiàn)
01傳統(tǒng)光片成像的瓶頸與突破思路
傳統(tǒng)光片顯微術（如斜平面顯微鏡OPM）受光的衍射特性限制，即使采用高數(shù)值孔徑物鏡（NA~1.3），光片厚度也難以突破1–2微米，導致相鄰亞細胞結構（如間隔<1微米的細胞膜）在成像中嚴重模糊。為解決這一問題，研究團隊引入可逆飽和光學熒光躍遷（RESOLFT）原理，利用RSFPs的“開-關”雙穩(wěn)態(tài)特性——通過405nm寬場光將所有熒光蛋白激活為“開”狀態(tài)，再以488nm正弦干涉圖案光（周期1.2微米，傾斜35°）精準關閉大部分區(qū)域的熒光，僅保留納米級厚度的發(fā)光片層。
02多片層并行化成像的核心機制
多片層RESOLFT的關鍵在于“光片印記-快速讀取”的創(chuàng)新流程：
光片印記：通過調(diào)節(jié)“關閉光”的功率和持續(xù)時間，可將發(fā)光片層厚度壓縮至100–200納米，較傳統(tǒng)OPM光片薄10倍以上（圖1b）。
快速讀取：使用488nm光片逐片激發(fā)印記的發(fā)光層，通過匹配光片間距與讀取光的艾里斑零強度點，避免相鄰層串擾。單次體積成像僅需10–20次熒光開關循環(huán)，顯著降低光漂白風險。
在虛擬多膜結構模擬中（圖2a），傳統(tǒng)OPM無法區(qū)分間隔500納米的三層膜，而多片層RESOLFT通過超分辨斷層清晰解析了各層結構。在活細胞實驗中，研究團隊利用MAP2-rsEGFP(N205S)標記微管，實現(xiàn)了軸向分辨率<200納米的三維成像（圖3），并以2秒/體積的速度追蹤肌動蛋白網(wǎng)絡30分鐘（圖4），信號衰減僅25%。
此外，該技術成功記錄了HeLa細胞4小時內(nèi)的分裂全過程（圖5），以及病毒樣顆粒在細胞膜表面的動態(tài)聚集（圖6），展現(xiàn)了其在動態(tài)生物學研究中的強大潛力。
創(chuàng)新與亮點
01突破衍射極限的“納米級光片”
傳統(tǒng)光片成像的分辨率由光片厚度和檢測系統(tǒng)共同決定，而多片層RESOLFT通過光學調(diào)控熒光蛋白開關狀態(tài)，繞過了光的物理衍射限制。實驗顯示，其有效光片厚度可穩(wěn)定控制在100–200納米，使三維體積分辨率達到250納米以下（x/y/z軸），首次在光片技術中實現(xiàn)了“超分辨斷層”能力。
相比傳統(tǒng)超分辨技術（如STED）需要數(shù)百次開關循環(huán)，多片層RESOLFT將單次體積成像的循環(huán)次數(shù)壓縮至10–20次，結合0.7秒/體積的超快采集速度，顯著降低了光毒性。這使得長達數(shù)小時的活細胞延時成像成為可能，例如連續(xù)4小時追蹤細胞分裂過程中染色體的動態(tài)變化（圖5），而傳統(tǒng)方法因光損傷難以實現(xiàn)。
03兼容性與多功能拓展
該技術對RSFPs的開關循環(huán)次數(shù)要求極低，可兼容rsEGFP2、rsEGFP(N205S)等多種熒光蛋白，并支持多色成像拓展。此外，其光學系統(tǒng)基于商用組件構建（僅衍射光柵需定制），兼容標準蓋玻片，為高通量活細胞成像奠定了基礎。
總結與展望
多片層RESOLFT顯微術通過光片技術與超分辨原理的跨維度融合，突破了傳統(tǒng)光學成像在分辨率、速度與光損傷之間的固有矛盾，為解析亞細胞結構的時空動態(tài)提供了革命性工具。當前技術已實現(xiàn)140×84×15微米3體積的高速成像，未來通過升級激光器功率和相機靈敏度，有望將采集速度提升至0.5秒/體積以下，并進一步拓展至更大樣本（如類器官）和更深組織（需結合像差校正技術）。
在應用層面，該技術可廣泛用于腫瘤細胞遷移機制、病毒組裝路徑、細胞器互作網(wǎng)絡等前沿領域，甚至為實時監(jiān)測藥物對亞細胞結構的動態(tài)影響提供可能。隨著RSFPs光譜多樣性的提升和自動化算法的優(yōu)化，多片層RESOLFT或?qū)⑼苿庸馄上駨摹昂暧^觀察”邁向“納米級動態(tài)解析”，成為連接分子生物學與細胞生物學的關鍵橋梁。
正如研究團隊在討論中指出，這項技術不僅是光學成像的一次技術突破，更預示著“智能光片”時代的到來——通過動態(tài)調(diào)控光開關圖案與熒光蛋白行為，未來的光片顯微鏡或?qū)崿F(xiàn)分辨率、速度與成像深度的按需切換，為生命科學研究帶來無限想象空間。
論文信息聲明：本文僅用作學術目的。
Bodén A, Ollech D, York AG, Millett-Sikking A, Testa I. Super-sectioning with multi-sheet reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) microscopy.
DOI:10.1038/s41592-024-02196-8.
