Stargardt 病（STGD1）是一種由 ABCA4 基因的雙等位基因變異引起的遺傳性黃斑變性疾病。ABCA4 基因編碼一種定位在光感受器外段的轉運蛋白，負責清除視覺循環(huán)中的有毒副產(chǎn)物。目前已發(fā)現(xiàn)超過 1,200 種 STGD1 致病性變異，其中約 10% 是隱藏在基因深處的“深內含子（deep-intronic, DI）突變”——它們會讓細胞在讀取基因時錯誤插入多余的“偽外顯子”，導致生成的蛋白質無法正常工作或被提前降解。目前，在研的反義寡核苷酸療法需要為每個突變單獨設計序列，適用范圍很小。因此，開發(fā)一種糾正不同位點突變引起的剪接缺陷的通用療法具有重要意義。

近日，荷蘭內梅亨大學醫(yī)學中心和烏特勒支大學藥物科學研究所的科研團隊在 Molecular Therapy – Nucleic Acids 雜志上聯(lián)合發(fā)表了一項突破性研究。他們利用 CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)，結合兩組導向 RNA（gRNA），分別靶向 ABCA4 基因中兩個高頻 DI 變異區(qū)域（內含子 30 和 36），并通過脂肽 C18:1-LAH5 實現(xiàn) Cas9 核糖核蛋白（Cas9 ribonucleoproteins, Cas9 RNP）的高效遞送。該策略不僅能精準切除錯誤插入的基因片段，還能保留正常蛋白功能。該策略在視網(wǎng)膜前體細胞中的成功應用，為開發(fā)通用型基因療法奠定了基礎。這項突破不僅為 Stargardt 病患者帶來新希望，也為其他遺傳病的治療開辟了新思路。

一、RPNCs 綜合表征
研究者分別設計了靶向 ABCA4 基因內含子 30 和 36 的 gRNA，并選擇了油酸修飾的 LAH5 多肽（即脂肽 C18:1-LAH5）作為遞送載體。C18:1-LAH5 與 Cas9 RNP 孵育后形成納米復合物（ribonucleoprotein nanocomplexes, RPNCs），通過動態(tài)光散射（DLS）監(jiān)測 RPNC 的形成。結果顯示，隨著 Cas9 RNP: 脂肽比例提高，RPNCs 的粒徑減小，平均粒徑在 151-191 nm 之間；隨著脂肽濃度的增加，RPNCs 的 Zeta 電位逐步升高（圖 1A），此外，電泳遷移率轉移試驗（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）顯示（圖 1B），RPNCs 的遷移率隨著脂肽濃度的增加顯著降低，在 GFP-Cas9:ATTO550-gRNA:ATTO647-gRNA:脂肽=1:1:1:50 的比例下即可合成 RPNCs 穩(wěn)定產(chǎn)物。綜上結果表明，脂肽 C18:1-LAH5 能夠與 Cas9 RNP 高效結合，形成穩(wěn)定的納米復合物。

圖1. RNP 和 C18:1-LAH5 脂肽不同比例下合成的 RPNCs 表征

利用 NanoFCM 在單顆粒水平對 RPNCs 進行綜合表征，檢測參數(shù)包括顆粒粒徑、濃度和包封率等多個維度。結果顯示，與不含 C18:1-LAH5 脂肽的樣品相比，Cas9 RNP 與 C18:1-LAH5 脂肽形成 RPNCs 后（無論是單個 gRNA 還是兩個 gRNA 的組合）中位直徑和熒光陽性顆粒的濃度均顯著增加（圖 2A-D）；此外，RPNCs 在單顆粒水平兩種 gRNA 雙陽的比例高達 84%，比不含脂肽的樣品比例高出 70 倍（圖 2E-F）。綜上表明，C18:1-LAH5 脂肽能夠有效促進復合物形成 RPNCs，而不含 C18:1-LAH5 脂肽的樣本中熒光顆粒很可能是 Cas9 RNP  的聚集物。
 

圖2. NanoFCM 對 RPNCs 的綜合表征

二、細胞攝取效率
為了觀察細胞對 RPNCs 的攝取，在 HeLa 細胞中加入 RPNCs，并在分別培養(yǎng) 2、4、12、24 小時后進行熒光共聚焦成像。結果顯示，隨培養(yǎng)時間的延長，GFP-Cas9、ATTO550-gRNA1和ATTO647-gRNA2 的熒光信號均逐步增強，表明 HeLa 細胞能同時攝取 RPNCs 中的 Cas9 和兩種 gRNA（圖 3）。
 

圖3. 共聚焦熒光顯微鏡下細胞攝取 RPNCs

三、基因編輯效率
明確了細胞對 RPNCs 的有效攝取后，為了驗證 RPNCs 模型的基因編輯能力，研究者們選用了 HEK293T stoplight 和 eGFP HEPA 兩種熒光報告細胞系對 RPNCs 的編輯效率進行評估。首先在 HEK293T stoplight 細胞系中分別使用脂肽 C18:1-LAH5 和 LAH5 修飾的 RPNCs 進行 eGFP 的插入，如圖 4A、B 所示，脂肽 C18:1-LAH5 的組別中 eGFP 的表達量顯著高于 LAH5；而后在 eGFP HEPA 細胞中進行 eGFP 敲除，如圖 4C、D 所示，脂肽 C18:1-LAH5 的組別敲除比例顯著高于 LAH5，且隨濃度升高而升高。綜上表明 RPNCs 能夠有效地對目標片段進行插入和敲除，而脂肽 C18:1-LAH5 的遞送效率顯著高于 LAH5，且 RNP 與脂肽比例為 1:250 時均呈現(xiàn)較高的編輯效率。

圖4. 兩種熒光報告細胞系中 RPNCs 的基因編輯效率

在明確 RPNCs 的最優(yōu)合成比例、遞送條件后，研究者們在 HeLa 細胞、患者來源的成纖維細胞、誘導多能干細胞衍生的光感受器前體細胞（PPCs）等不同來源細胞系中進行了細胞攝取實驗，探究了 RPNCs 的基因編輯效率，例如在成纖維細胞模型中，針對內含子 30，gRNAs（30 1+2）在對照組和 STGD1 患者組中均實現(xiàn)了部分內含子移除，編輯效率均在 75% 左右，顯著高于 gRNAs（30 3+4）（圖 5A）。針對內含子 36，兩對 gRNA（gRNAs 36 1+2和gRNAs 36 1+3）都能誘導部分缺失，效率均為 40% 左右（圖 5B）。此外，研究者們還在基因組水平、RNA 水平和蛋白質水平對 RPNCs 的基因剪切、剪切后修復等方面進行了研究，證明了脂肽 C18:1-LAH5 修飾的 RPNCs 在不同細胞模型中均表現(xiàn)出優(yōu)秀的基因編輯效率，為 STGD1 的治療提供了有力支持。

圖5. 成纖維細胞中 RPNCs 的基因編輯效率

研究意義
該研究提出了一種基于脂肽介導 CRISPR-Cas9 遞送的通用基因編輯策略，能夠糾正 ABCA4 基因中由 DI 突變引起的剪接缺陷。這種方法不僅適用于特定突變，還可以同時糾正多個突變，為 STGD1 的治療提供了一種潛在的通用解決方案。此外，脂肽遞送還為非病毒遞送系統(tǒng)在基因編輯中的應用提供了新的思路和方法，推動了基因編輯技術在眼科領域的應用。

展望
NanoFCM 能在單顆粒水平對納米級顆粒的物理化學性質（如粒徑、熒光強度等）進行綜合表征。在基因編輯領域，NanoFCM 可用于表征 RPNCs 的粒徑分布、包封效率、熒光強度等多維信息，這有助于深入理解 RPNCs 的理化性質，為遞送系統(tǒng)的研發(fā)和優(yōu)化提供有力支持。展望未來，隨著基因編輯技術的持續(xù)發(fā)展，對載體質量、荷載效率等關鍵指標的檢測勢必會成為常規(guī)要求，NanoFCM 有望成為基因編輯載體質量控制和穩(wěn)定性評估等指標的關鍵表征工具，為臨床科研和產(chǎn)業(yè)化提供便捷且精準的檢測方式，推動新型治療技術的發(fā)展！