數據非依賴采集（DIA）可通過劃分采集窗口，將所有檢測范圍內的離子進行碎裂和掃描，定量準確性高、重現性好、蛋白質組覆蓋深度廣，尤其適合低豐度肽段的檢測。但現有DIA數據分析方法主要依賴譜圖庫或直接數據庫搜索，但兩者均受限于數據庫中的已知肽段列表，難以發現由遺傳變異或突變產生的新生肽段。2025年5月30日，Bioinformatics Solutions Inc.發表了最新預印本文章 ^[1]，介紹了一種直接從復雜的DIA譜圖中發現低豐度突變肽段的算法，同時嚴格控制FDR。

DIAVariants工作流程
如圖1所示，讀取數據后，首先進行MS1特征峰提取，以識別電離肽段產生的具有明確同位素的可靠MS1信號響應。接下來進行PEAKS DIA數據庫搜索，將譜圖與參考蛋白質序列庫比對，篩選FDR小于1%的可信肽段，并基于保留時間和母離子 m/z與MS1特征峰關聯。
對數據庫匹配不可信的MS1特征峰，利用DIA de novo預測與關聯MS2最佳匹配的肽段序列。然后通過SPIDER算法，基于de novo預測的序列、MS1特征峰信息和參考序列校正測序錯誤。SPIDER候選肽段中，僅保留包含1-2個突變位點的序列，下一步預測這些候選突變肽的索引保留時間(iRT)，通過RT回歸模型轉換為實驗RT，過濾掉預測iRT與實測RT差異顯著的突變肽段。最后，將候選突變肽與數據庫搜索得到的肽段合并構建臨時譜圖庫，基于實測RT進行PEAKS DIA譜圖庫搜索，通過Q值控制FDR。

圖1 DIAVariant方法流程

結果展示
PEAKS DIA直接數據庫搜索性能
下載兩個公開質譜數據集（PXD046453、PXD050030），采用相同的database和參數，分別使用PEAKS DIA DB search和DIANN2.1進行分析，結果如表1所示，從定量蛋白數量、CV指標來看，兩者在DIA蛋白質組數據的定量性能上，穩定性和靈敏度均較高。
表1 文獻數據分析結果對比
跨物種搜索驗證DIAVariants特異性
在ABRF人類樣本（搜索小鼠數據庫）和MSV000095360小鼠樣本(搜索人類數據庫)的結果中，DIAVariant報告的肽段變體中85%以上可在本物種數據庫中被可信鑒定(q-value <0.01)，驗證了算法的高特異性(表2)。 表2 跨物種檢索結果
與蛋白基因組方法對比
Fierro-Monti等 ^[2]曾對Hela細胞樣本進行外顯子組測序，通過蛋白基因組的方法構建了233個經典蛋白變體，將其加入人類參考序列數據庫后，使用DIANN 1.8.1檢索到了相應的DIA數據，并通過同位素合成肽段和靶向驗證，最終報告了6個肽段變體。我們下載了文獻中的原始數據，用DIAVariants直接分析，結果成功鑒定到了上述6條肽段變體的其中2條(LEQDLQQIQAK 和 NELSGALTGLIR)(表 3)，并且額外發現426個低豐度潛在多肽變體。這些低豐度肽段因MS1信號弱，難以通過DDA數據檢測，更加顯示了DIA-MS在低豐度肽段檢測中的優勢。
表3 DIAVariants與蛋白基因組報道肽段對比。 小結
DIAVariant通過整合DIA數據庫搜索、從頭測序和同源校正，提供了一種高效、無偏的DIA數據突變肽段識別方法，可同時檢測參考數據庫內的已知肽段和數據庫外的肽段變體，尤其適用于低豐度肽段和復雜遺傳變異的分析。該方法為蛋白質組學中序列變體的發現提供了新工具，有望推動精準醫學和癌癥新抗原研究的發展。但目前僅驗證了1-2個氨基酸突變位點，未涉及插入和缺失的情況，未來算法仍會繼續擴展。

參考文獻
[1] Qiao, R., et al. (2025). "De Novo sequencing-assisted homology search for DIA data analysis enables low abundance peptide variants discovery." doi: https://doi.org/10.1101/2025.05.30.657054.
[2] Fierro-Monti, Ivo, et al. "Assessment of Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry (DIA-MS) for the Identification of Single Amino Acid Variants." Proteomes 12.4 (2024): 33.
原文鏈接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.05.30.657054v1

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