在生物醫學領域，成像技術一直是探索生命奧秘的前沿工具。隨著科技的不斷進步，成像技術已不再局限于宏觀層面，而是深入到細胞和分子層面，為疾病診斷與治療提供有力支持。雙光子熒光成像，憑借其卓越的組織穿透能力、超高的分辨率以及對樣品的低光損傷等優勢，迅速成為生物醫學成像研究的熱點。而熒光材料作為成像技術的核心，其性能直接決定了成像效果。傳統的有機熒光材料在高濃度下容易發生聚集熒光猝滅，且抗光漂白能力有限。幸運的是，聚集誘導發光（AIE）材料的出現，為雙光子熒光成像帶來了新的曙光。AIE材料以其獨特的光物理性質，在高濃度或聚集狀態下展現出明亮的熒光和優異的抗光漂白能力，為生物醫學成像領域帶來了重大突破。

研究背景與技術挑戰
傳統成像技術的局限性
生命活動的復雜性決定了生物體內存在多種離子、小生物分子、生物大分子等成分。這些成分在維持細胞正常生理功能、傳遞信號以及參與疾病進程等方面扮演關鍵角色。熒光成像技術通過特定的熒光材料與目標分子結合，實現對這些生物成分的可視化檢測。然而，傳統的單光子熒光成像技術在組織深層成像時存在諸多限制，如穿透深度淺、背景信號干擾強等。

雙光子成像技術的優勢與挑戰
雙光子熒光成像技術應運而生，利用近紅外光激發，能夠在樣品內部焦點位置產生熒光信號，從而實現深組織穿透和超高分辨率成像。盡管雙光子成像具有諸多優勢，但對熒光材料的要求也更為苛刻。一方面，雙光子成像過程中使用的激光能量較強，傳統的有機熒光材料在強光照射下容易發生光漂白現象，導致信號衰減，影響成像質量；另一方面，為了獲得足夠的信號強度，需要較高濃度的熒光材料，而高濃度下傳統的有機熒光材料容易發生聚集，進而導致熒光猝滅。此外，傳統的有機熒光材料在生物體內容易被代謝排出，難以實現長期動態追蹤。

技術創新與應用
AIE材料的獨特優勢
AIE材料是一類具有獨特光物理性質的新型熒光材料。其核心機制在于限制分子內運動（RIM）。在單分子狀態下，AIE材料的分子內運動較為自由，導致熒光較弱；而在聚集態或固態時，分子內運動受到限制，激發態能量以熒光形式釋放，從而展現出明亮的熒光。這一特性使得AIE材料在高濃度或聚集狀態下依然能夠保持強發光性能，并且具有優異的抗光漂白能力。在生物體內，AIE材料通常以納米聚集體的形式存在，難以被生物體快速代謝排出，為長期動態追蹤提供了可能。

熒光檢測應用
AIE材料在熒光檢測領域的應用前景廣闊。通過設計基于AIE材料的探針，可以實現對多種生物分子和離子的高靈敏度、高選擇性檢測，此外，還有基于AIE材料的探針用于檢測生物分子。這些探針在雙光子激發下能夠快速響應目標分子，并具有較低的檢測限，為生物醫學分析提供有力工具。

細胞成像應用
AIE材料在細胞成像領域同樣表現出色，能夠實現對多種細胞器的特異性成像。通過簡單的化學修飾，AIE材料可以靶向細胞內的內質網、線粒體、溶酶體等細胞器，實現對這些細胞器的精確成像。例此外，AIE材料還被用于線粒體成像，通過帶正電荷的AIE材料與線粒體的靜電相互作用，實現了對線粒體的特異性染色，并在活細胞中實現了長期穩定的成像。

組織成像應用
AIE材料在組織成像方面的優勢更為顯著。它們能夠快速、特異性地標記活細胞和活體組織中的脂滴，即使在超低濃度下也能實現這一目標。例如，Tang和Yu團隊合成了一組基于AIE的熒光探針，這些探針在50納米濃度下能夠快速標記活細胞中的脂滴，這是目前報道的脂滴標記最低濃度。這些探針還被成功用于活體小鼠肝組織中脂滴的雙光子成像，成像深度達到70微米。此外，AIE材料還被用于深組織成像，如在活體小鼠肝組織中，基于AIE的點在雙光子激發下實現了超過200微米的深組織成像，而單光子成像的深度不足100微米。

活體血管成像應用
AIE材料在活體血管成像中的應用為研究腫瘤血管和腦血管等復雜血管系統提供了新的視角。腫瘤血管在腫瘤的生長和轉移過程中起著關鍵作用，其結構和功能通常存在異常。利用AIE材料的雙光子熒光成像技術，可以清晰地識別和監測腫瘤血管的結構、形態以及正常化過程。例如，基于化合物的近紅外AIE點展現出高量子產率（19±1%）和超大的雙光子吸收截面。在雙光子近紅外二區激發下，小鼠腦血管被清楚成像，成像深度達到924微米。同時，該材料成功實現了對腫瘤血管與正常血管的區分，并在雙光子近紅外二區激發下實現了對深層腫瘤血管網絡的無創實時成像，成像深度達到670微米，信號背景比約為120。

成像實驗與結果分析
熒光強度與信號穩定性
AIE材料在雙光子激發下能夠產生明亮且穩定的熒光信號，這得益于其獨特的AIE特性和抗光漂白能力。在實驗中，基于AIE材料的探針在長時間的激光照射下仍能保持較高的熒光強度，而傳統的有機熒光材料則會出現明顯的光漂白現象，信號強度逐漸減弱。這種穩定的信號輸出為長時間的成像實驗提供了可靠保障，使得研究人員能夠更準確地觀察生物過程的動態變化。

成像分辨率與深度
從成像分辨率和深度來看，AIE材料在高濃度或聚集狀態下依然能夠保持良好的發光性能，使得成像設備能夠獲取到更深層次組織的清晰圖像。例如，在對小鼠腦血管的成像實驗中，基于AIE材料的探針在雙光子近紅外二區激發下，實現了924微米的超深成像深度，而傳統的單光子成像技術通常只能達到100微米左右的深度。這種深成像能力為研究大腦深部區域的血管結構和功能提供了前所未有的機會，有助于揭示神經退行性疾病等復雜疾病的病理機制。

生物相容性與代謝行為
在生物相容性和代謝行為方面，AIE材料展現出了顯著的優勢。實驗結果表明，AIE材料在生物體內具有良好的穩定性和生物相容性，不會引起明顯的免疫反應或其他不良生理效應。此外，由于AIE材料在生物體內難以被快速代謝排出，其能夠在較長時間內保持成像效果，為動態追蹤生物過程提供了可能。例如，在對腫瘤血管的長期監測實驗中，基于AIE材料的探針能夠在數天甚至數周內持續提供清晰的血管圖像，有助于研究人員觀察腫瘤血管在治療過程中的動態變化。

多模態成像融合
AIE材料還具備與其他成像技術融合的潛力，實現多模態成像。例如，通過將AIE材料與磁共振成像（MRI）對比劑相結合，可以同時獲得高分辨率的熒光圖像和深層次的MRI圖像，從而更全面地了解生物組織的結構和功能。這種多模態成像技術的融合為疾病的早期診斷和精準治療提供了更強大的工具，能夠滿足臨床實踐中對成像技術的多樣化需求。

總結與展望
AIE材料憑借其獨特的光物理性質，在雙光子熒光成像領域展現出巨大的應用潛力。從熒光檢測到細胞成像、組織成像以及活體血管成像，AIE材料的應用范圍不斷擴大，為生物醫學研究提供了豐富而精準的成像工具。然而，盡管取得了一系列突破性進展，AIE材料在雙光子生物成像領域仍面臨諸多挑戰。未來，AIE材料的研究方向將更加多元化。一方面，科研人員需要進一步拓展AIE材料的檢測范圍，將其應用于DNA、蛋白質、酶等生物大分子以及手性分子的檢測。這將為生物醫學研究提供更全面的檢測手段，有助于揭示更多生命活動的奧秘。另一方面，針對特定細胞器的AIE材料研發也將成為重點。通過與特定細胞器靶向肽的結合，實現對高爾基體、細胞核、核仁等重要細胞器的精準成像。同時，考慮到神經細胞中細胞器的特殊性，開發適用于神經細胞的細胞器靶向AIE材料將具有重要意義，有助于深入研究神經系統疾病的發生機制。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Lu Q, Wu CJ, Liu Z, Niu G, Yu X. Fluorescent AIE-Active Materials for Two-Photon Bioimaging Applications. Front Chem. 2020 Dec 14;8:617463. 

DOI:10.3389/fchem.2020.617463.