在生物醫學成像領域，雙光子激發（TPE）熒光成像技術正嶄露頭角，為科學家們提供了一種強大的工具，尤其在視網膜神經節細胞（RGCs）的研究中，展現出巨大的應用潛力。視網膜作為唯一可以通過光學非侵入性成像單個神經元的組織，其神經節細胞的動態變化對于眼科學研究具有關鍵意義。然而，傳統的成像技術在研究視網膜神經節細胞功能和結構時存在諸多限制，例如穿透深度不足、光毒性較大以及無法實現三維高分辨率成像等。雙光子掃描激光檢眼鏡的出現，為解決這些難題提供了新的思路和方法。將深入探討雙光子掃描激光檢眼鏡技術的原理、優勢以及在視網膜神經節細胞成像中的應用前景。

研究背景與技術挑戰
視網膜神經節細胞的功能與特性
視網膜神經節細胞（RGCs）是視覺信息傳遞的關鍵神經元，其軸突組成視神經，將光信號轉換為神經信號傳遞到大腦。這些細胞在視覺信息處理中起著至關重要的作用，包括視覺敏銳度和對比敏感度的形成。RGCs存在多種亞型，具有不同的功能特性，但目前對于活體內單個RGCs的功能分析仍較為缺乏，這限制了我們對視網膜疾病的深入理解。

視網膜成像技術的局限性
傳統的視網膜成像技術如共聚焦掃描激光檢眼鏡（CSLO），雖然實現了對視網膜細胞的非侵入性觀察，但在功能成像方面存在挑戰。例如，CSLO主要依賴于熒光報告分子的結構成像，難以直接反映細胞的功能狀態。此外，由于哺乳動物視網膜中視錐細胞和熒光報告分子的光譜敏感性存在重疊，導致在功能成像時容易產生干擾，影響對視網膜功能的準確評估。

雙光子激發技術的優勢
雙光子激發（ TPE）熒光成像技術利用紅外光脈沖激發熒光物質，實現了高穿透深度和固有的三維切片能力。與傳統的單光子激發相比，TPE技術具有更高的組織穿透力，能夠深入觀察視網膜的深層結構。同時，由于使用長波長的紅外光，TPE技術有效降低了光毒性，減少了對視網膜細胞的損傷，特別適合于活體內的長期觀察。此外，TPE技術通過雙光子吸收過程實現非線性激發，僅在焦平面附近產生熒光信號，從而實現了更高的軸向分辨率，為視網膜神經節細胞的三維成像提供了優異的條件。

技術創新與應用
雙光子激發的理論基礎
雙光子激發熒光成像的核心原理在于雙光子吸收（TPA）過程。在TPA中，兩個低能量光子同時被吸收，其總能量等于分子從基態躍遷到激發態所需的能量。這種非線性吸收過程的概率與入射光的強度平方成正比，因此需要高功率的脈沖激光源來實現有效的激發。通過使用飛秒脈沖激光，TPE技術能夠在保證高激發效率的同時，將光脈沖持續時間控制在極短范圍內，從而提高雙光子信號的生成效率。

雙光子掃描激光檢眼鏡的系統設計
雙光子掃描激光檢眼鏡系統基于空芯光纖（ HCF）平臺，實現了共聚焦反射和雙光子成像的同時進行。該系統采用激光器作為光源，通過傳輸激光，系統被分為緊湊的應用單元和獨立的激光單元，避免了脈沖展寬的問題。此外，系統集成了實時眼動追蹤軟件，能夠在低信號水平和光學聚焦條件不理想的情況下，延長相同位置的信號采集時間，從而提高成像質量。

內源性熒光物質的應用
除了外源性熒光報告分子，TPE技術還可以激發內源性熒光物質。這些內源性熒光物質在視網膜細胞中自然存在，通過雙光子激發可以獲得它們的熒光信號，進而實現視網膜結構和功能的成像。這種方法避免了外源性熒光標記可能帶來的細胞毒性等問題，為視網膜疾病的診斷和研究提供了更為安全和便捷的手段。

成像實驗與結果分析
實驗設置與動物模型
實驗使用了Thy1-YFP-16和Thy1-GCaMP3兩種轉基因小鼠模型。這些小鼠的視網膜神經節細胞分別表達黃色熒光蛋白（YFP）和鈣離子指示劑GCaMP3，便于通過雙光子掃描激光檢眼鏡進行成像觀察。在實驗過程中，小鼠被麻醉并進行處理，以確保成像過程的穩定性和圖像質量。成像系統通過空芯光纖將激光傳輸至小鼠視網膜，并收集反射和熒光信號，實現了對視網膜神經節細胞的高分辨率成像。

視網膜神經節細胞的成像結果
在 Thy1-YFP-16小鼠模型中，雙光子掃描激光檢眼鏡成功獲取了視網膜神經節細胞的圖像，同時結合共聚焦反射成像提供了視網膜的解剖結構參考。實驗結果顯示，TPE圖像能夠清晰地顯示出視網膜神經節細胞的形態和分布，而熒光壽命成像（FLIM）進一步提供了細胞健康狀態的信息。通過比較不同深度的視網膜成像，研究人員能夠觀察到視網膜神經纖維層和神經節細胞層的結構變化，為研究視網膜疾病的進展提供了重要的數據。

功能性成像的探索
在 Thy1-GCaMP3小鼠模型中，研究人員利用雙光子掃描激光檢眼鏡成功實現了對視網膜神經節細胞的鈣離子動態成像。盡管在低功率水平下成像，仍能夠清晰地觀察到單個RGCs的熒光信號，這表明TPE技術具有檢測視網膜神經節細胞功能變化的潛力。通過動態監測GCaMP3的熒光變化，可以實時觀察視網膜神經節細胞在生理刺激下的活動狀態，為研究視網膜神經節細胞的功能和疾病相關的功能障礙提供了新的視角。此外，熒光壽命成像也有望在區分不同功能狀態的RGCs亞型方面發揮重要作用，為深入了解視網膜疾病的發病機制提供了可能。

總結與展望
雙光子掃描激光檢眼鏡技術作為一種新興的視網膜成像工具，憑借其高組織穿透力、低光毒性和固有的三維切片能力，在視網膜神經節細胞的結構和功能成像方面展現出巨大的應用潛力。通過激發外源性和內源性熒光物質，該技術能夠實現對視網膜細胞的高分辨率成像，并提供細胞健康狀態和功能活動的重要信息。在實驗研究中，雙光子掃描激光檢眼鏡成功地對活體小鼠視網膜神經節細胞進行了動態觀察，不僅實現了細胞結構的可視化，還初步探索了細胞功能成像的可行性，為視網膜疾病的機制研究和治療效果評估提供了有力的技術支持。

未來，隨著技術的不斷進步和優化，雙光子掃描激光檢眼鏡有望在臨床診斷和治療監測中發揮更重要的作用。然而，目前該技術在臨床轉化方面仍面臨一些挑戰，如設備的便攜性、操作的簡便性以及成像速度的提升等。此外，如何進一步提高成像的分辨率和靈敏度，以及如何開發更多適用于臨床的熒光探針和成像模式，也是未來研究的重要方向。盡管如此，雙光子掃描激光檢眼鏡技術的出現無疑為眼科學領域帶來了一場成像技術的革新，為揭開視網膜疾病的神秘面紗提供了新的希望和可能。我們期待在不久的將來，這項技術能夠在臨床應用中大放異彩，為人類的視覺健康保駕護航。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Kamali T, Farrell SRM, Baldridge WH, Fischer J, Chauhan BC. Two-Photon Scanning Laser Ophthalmoscope. 2019 Aug 14. In: Bille JF, editor. High Resolution Imaging in Microscopy and Ophthalmology: New Frontiers in Biomedical Optics [Internet]. Cham (CH): Springer; 2019. Chapter 9. 

DOI：10.1007/978-3-030-16638-0_9.