靶向藥物遞送是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的重要研究方向，通過將藥物精準(zhǔn)輸送至病灶部位，顯著提升藥物治療效果，同時(shí)減少藥物用量、降低副作用。然而，靶向遞送系統(tǒng)的開發(fā)面臨諸多挑戰(zhàn)，包括如何在不影響健康組織的前提下將藥物遞送到特定組織或細(xì)胞，以及應(yīng)對(duì)生物屏障、免疫清除、局部控制藥物釋放和在不引起不良反應(yīng)的情況下保證藥物生物相容性與安全性等問題。  

細(xì)胞外囊泡（EVs）因其天然的來(lái)源、優(yōu)異的生物相容性、可運(yùn)輸多種分子以及組織靶向性而被認(rèn)為是理想的藥物遞送載體。然而，EVs 的組織特異性及來(lái)源細(xì)胞對(duì) EVs 生物分布的影響尚未完全明確，且由于其異質(zhì)性強(qiáng)、尺寸微小以及半衰期短，很難系統(tǒng)地開展針對(duì) EVs 的生物分布和組織趨向性的研究。因此，如果有一種方式可以監(jiān)測(cè)和量化體內(nèi) EVs 的生物分布，這將極大地促進(jìn)該領(lǐng)域的發(fā)展。

2025年1月16日，阿斯利康位于瑞典的研發(fā)團(tuán)隊(duì)在 Advanced Science 上發(fā)表了一篇題為“Barcoded Hybrids of Extracellular Vesicles and LiPId Nanoparticles for Multiplexed Analysis of Tissue Distribution”的研究論文。該研究開發(fā)出一種 EVs 與攜帶單鏈 DNA 條碼（DNA Barcode）的 LNPs 融合的技術(shù)，利用 DNA 條形碼作為區(qū)分不同來(lái)源 EVs 的依據(jù)，創(chuàng)建了獨(dú)特的帶有條形碼的雜交 EV 顆粒（hybrid EV particle, hEV）文庫(kù)，實(shí)現(xiàn)了在單個(gè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)追蹤多種 EVs，這一方法能夠高效地獲取大量的 EVs 生物分布數(shù)據(jù)，為繪制組織趨向圖和識(shí)別潛在的組織特異性藥物遞送載體提供了有力工具，對(duì)靶向藥物遞送領(lǐng)域的研究具有重要意義。

一、hEVs 的綜合表征
本研究開發(fā)了一種 pH 依賴的方法，通過控制 EVs 與 LNPs 在酸性環(huán)境中融合，成功制備了 hEVs。納米顆粒跟蹤分析（NTA）顯示，EVs 粒徑平均值為 117 nm，LNPs 為 67 nm，而融合后的 hEVs 在 174 nm 處出現(xiàn)額外峰（圖1d），表明 EVs 與 LNPs 發(fā)生融合。透射電子顯微鏡結(jié)合免疫金標(biāo)記進(jìn)一步確認(rèn)了 EVs 標(biāo)記物 CD81 和 CD63 與 LNPs 組分 PEG 共存于同一顆粒上（圖1f）。Western blotting 對(duì)細(xì)胞、EVs 和 hEVs 樣品的蛋白質(zhì)分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)這種 pH 依賴的方法成功制備了 hEVs。此外，利用 NanoFCM 的單分子檢測(cè)能力驗(yàn)證條碼封裝效率，結(jié)果顯示，hEVs 的條碼封裝效率為 60%，而 LNPs 的封裝效率超過 98%（圖1e）。綜上所述，這些結(jié)果表明開發(fā)的 pH 依賴法能夠?qū)崿F(xiàn) hEVs 的合成，并通過與 LNPs 融合使其裝載 DNA 貨物。

圖1. 雜交細(xì)胞外囊泡（hEVs）的形成與表征

二、不同來(lái)源 hEVs 條碼唯一性分析
研究者選取了 16 種不同細(xì)胞系（涵蓋肝、肺、胰腺、結(jié)腸、肌肉、血液、乳腺、宮頸和干細(xì)胞等，見下表），以研究 EVs 在體內(nèi)的分布。通過粒徑和濃度分析，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞系的 EVs 產(chǎn)量和大小存在差異，但細(xì)胞數(shù)量與 EVs 產(chǎn)量之間并無(wú)相關(guān)性（圖2b）。隨后，研究者對(duì)源自不同細(xì)胞系的 EVs 進(jìn)行唯一條碼標(biāo)記，構(gòu)建了帶有獨(dú)特條碼的 hEVs 庫(kù)，并評(píng)估了 DNA 條碼的裝載效率，結(jié)果顯示不同細(xì)胞系來(lái)源的 hEVs 的 DNA 裝載效率存在很大差異（圖2d）。

進(jìn)一步地，通過 NanoFCM 評(píng)估 hEVs 在存儲(chǔ)過程中的穩(wěn)定性及相互融合的潛力。首先，用 PE-TopFluoro AF488 分別標(biāo)記 Expi293F hEVs 和 HAP1 hEVs，同時(shí)在 HAP1 hEVs 中裝載 Cy5 標(biāo)記的 mRNA（Cy5陽(yáng)性率為35%），將 Expi293F-AF488 hEVs 和 HAP1-Cy5 hEVs 以1：1的比例混合共孵育。結(jié)果顯示，雙陽(yáng)顆粒比例僅為 2.4%（圖2f, g），表明異源 hEVs 在孵育期間保持穩(wěn)定。同源的 hEVs 混合后的雙陽(yáng)顆粒占 7.2%（圖2f, g），這表明同類型粒子之間可能存在一些內(nèi)在的相互作用。此外，基于 NanoFCM 超高的熒光靈敏度和熒光觸發(fā)模式，還發(fā)現(xiàn) hEVs 中存在游離的 mRNA（圖2g），這些成分可能會(huì)吸附在未染色的顆粒上，從而導(dǎo)致雙陽(yáng)顆粒的計(jì)數(shù)被高估。上述結(jié)果表明，hEVs 之間融合或依賴于特定類型，且在多路實(shí)驗(yàn)中條碼交換的風(fēng)險(xiǎn)較低。

圖2. 不同細(xì)胞系 EVs 唯一條碼標(biāo)記和穩(wěn)定性評(píng)估

三、hEVs 的體內(nèi)生物分布
為了驗(yàn)證 hEVs 是否能夠?qū)崿F(xiàn)高通量體內(nèi)生物分布分析，通過尾靜脈給藥研究混合 hEVs 在小鼠體內(nèi)的生物分布，給藥 1h 后根據(jù)下圖3a的均質(zhì)化方法準(zhǔn)備高通量測(cè)序分析（NGS）樣品。hEVs 體內(nèi)分布顯示，肝臟是大多數(shù)顆粒富集的主要目標(biāo)，而大腦和心臟組織是所有粒子最難到達(dá)的部位，說(shuō)明本研究開發(fā)的方法可以快速研究 hEVs 的生物分布。值得注意的是，57% HAP1 hEVs 在肺部富集，證實(shí) HAP1 hEVs 具有突出的肺部靶向潛力（圖3b）。

圖3. 不同來(lái)源 hEVs 的體內(nèi)生物分布分析

四、hEVs 的功能性遞送
為了評(píng)估 HAP1 hEVs 在體內(nèi)的遞送能力，研究者將負(fù)載 Cre mRNA 的 HAP1 hEVs  注射到 Cre 報(bào)告小鼠中，并于 4 天后通過 D-luciferin 成像檢測(cè)不同組織中的熒光素酶活性。結(jié)果顯示，在肝臟、脾臟和肺部觀察到熒光素酶活性，其中肝臟活性最高，脾臟和肺部次之（圖4e, f）。進(jìn)一步的免疫組化分析表明，HAP1 hEVs 主要在肺部的亞上皮區(qū)域被細(xì)胞攝取，且未觀察到與小血管附近的細(xì)胞攝取，這表明 HAP1 hEVs 能夠離開血管并穿透肺組織（圖4g, h, i）。綜上結(jié)果表明，條碼 hEVs 可以用于快速研究 EVs 的體內(nèi)分布，并有潛力成為精準(zhǔn)靶向的藥物遞送載體。
 

圖4. HAP1 hEVs 實(shí)現(xiàn) mRNA 向肺部的功能性遞送

結(jié)論
本研究開發(fā)的條碼 hEVs 技術(shù)為 EVs 的生物分布研究提供了一種高通量、多路復(fù)用的新方法，能夠快速分析不同來(lái)源 EVs 的組織趨向性，有助于加速 EVs 作為藥物載體的研究和開發(fā)。此外，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了 HAP1 hEVs 的肺部趨向性，為開發(fā)針對(duì)肺部疾病的靶向藥物提供了新的思路和工具。該技術(shù)有望進(jìn)一步優(yōu)化，以提高 EVs 的靶向效率和功能性藥物的遞送能力，為個(gè)性化醫(yī)療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供新的策略。

展望
NanoFCM 憑借其超高靈敏度和高通量檢測(cè)能力，在單顆粒水平對(duì) hEVs 進(jìn)行了全面表征，提供包括 hEVs 的粒徑分布、濃度、裝載效率和游離核酸比例等多維信息。這些詳盡的數(shù)據(jù)為深入探究 hEVs 生物分布以及繪制組織趨向圖提供了有力支持，進(jìn)而推動(dòng)了 EVs 作為藥物載體的進(jìn)一步開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。