酵母表達系統是真核表達系統中應用最廣泛的之一，其中巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii，又名PIchia pastoris）作為甲基營養型酵母的代表，近年來發展迅速，應用廣泛。

畢赤酵母：基因表達的新紀元
畢赤酵母表達系統誕生于上世紀80 年代初期，它融合了原核表達系統與真核表達系統的諸多優點，迅速在眾多表達系統中脫穎而出。與原核表達系統相比，它不僅保留了操作簡易、易于培養、生長速度快、表達量高、成本低等特性，還具備原核生物所欠缺的對外源蛋白的翻譯后修飾能力，如糖基化、蛋白磷酸化等，使表達的重組蛋白更接近天然產物。同時，它又克服了釀酒酵母分泌效率差、表達菌株不穩定、表達質粒易丟失等缺陷，成為外源蛋白表達的理想選擇。

畢赤酵母表達系統的主要優勢
1. 高效AOX1啟動子：目前最強、調控機制最嚴謹的啟動子之一，便于調控外源基因的表達。
2. 蛋白加工修飾功能：可對表達的外源蛋白進行糖基化、磷酸化、脂類酰化等翻譯后修飾，使重組蛋白與天然產物更相似。
3. 低成本與高效生長：菌株生長迅速，培養基成本低廉，培養條件簡單。
4. 高表達量：外源蛋白表達量高，支持胞內和分泌表達。
5. 基因穩定整合：外源基因能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝形式穩定整合，可穩定遺傳50代以上。
6. 高密度發酵：耐受高密度發酵，便于工業化生產。

 
P. pastoris生產重組蛋白的流程

畢赤酵母菌株多樣性
當前所采用的巴斯德畢赤酵母菌株都源自原始的Y-11430菌，常用的有GS115、KM71、X33和SMD1168等。蛋白胞內表達優先選MutS表型，分泌表達Mut + 和MutS均可；多數菌株如SMD1168、GS115、KM-71是組氨酸脫氫酶缺陷型，可用不含組氨酸培養基篩選重組子，且SMD1168為蛋白酶缺陷型，適合表達不穩定蛋白質或蛋白質復合物以避免內源性蛋白酶降解。但SMD1168菌株生長緩慢，導致蛋白質產量低。

畢赤酵母常用表達載體
畢赤酵母表達載體分為分泌型和非分泌型兩大類，分別適用于不同類型的蛋白質生產需求，其中分泌型載體利用釀酒酵母的分泌信號序列，有效引導外源蛋白的分泌，提高了蛋白的產量和純度。因此，深入了解和優化畢赤酵母表達載體，對于提升蛋白生產效率和質量至關重要，也是當前生物技術和基因工程研究中的熱點之一。

常見的用于生產分泌蛋白的畢赤酵母表達載體【1】

常見的用于生產胞內蛋白的畢赤酵母表達載體【1】

畢赤酵母基因改造技術
1. 基于線性化質粒載體的同源重組
同源重組技術是一種利用生物體自身修復機制的基因工程技術。在畢赤酵母中，通過將線性化的質粒載體引入，可以高效地將外源基因整合到宿主基因組的特定位點。這一過程依賴于同源臂序列，這些序列與目標基因組區域具有高度相似性，從而促進了質粒載體與宿主DNA之間的重組。這種方法的優勢在于其操作簡便、整合效率高，可以實現外源基因的多拷貝插入，這對于提高基因表達水平和蛋白質產量至關重要。在工業生產中，這種技術常被用于優化基因表達，以滿足生物制藥和工業酶生產的需求。此外，同源重組技術還可以用于基因功能研究、疾病模型構建以及生物技術產品的開發。

2. 基于CRISPR/Cas9的基因編輯
CRISPR/Cas9系統是一種革命性的基因編輯技術，它通過利用指導RNA（gRNA）引導核酸酶Cas9精確切割目標DNA序列。這種特異性的切割觸發了細胞內的修復機制，包括非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復（HDR），從而實現基因的敲除、插入或替換。CRISPR/Cas9技術以其高效性和精準性在基因組編輯領域占據重要地位，特別適用于復雜代謝途徑的優化和多基因編輯。在畢赤酵母中，CRISPR/Cas9技術已被廣泛應用于基因功能研究、菌株改良以及生產性能的提升。例如，通過敲除或替換特定基因，可以增強宿主菌的蛋白質表達能力或改變其代謝特性，以適應特定的工業生產需求。

3. 基于CRISPR/Cas12的基因編輯
CRISPR/Cas12系統，也稱為Cpf1，是CRISPR家族中的另一種基因編輯工具。Cas12蛋白具有廣泛的靶向能力和單鏈DNA切割特性，使其在基因組編輯中具有獨特的優勢。與Cas9相比，Cas12對靶位點的PAM（原始間隔短回文重復序列）依賴性更寬松，這為基因編輯提供了更大的靈活性。CRISPR/Cas12系統在表觀遺傳調控和新型生物技術的開發中展現出巨大潛力，例如，它可以用于研究基因沉默、激活以及DNA甲基化等表觀遺傳修飾。此外，Cas12的單鏈切割特性使其在開發新型核酸檢測技術、基因治療策略以及合成生物學應用中具有獨特的應用前景。在畢赤酵母中，CRISPR/Cas12技術的應用還相對較新，但已有研究表明，它在基因組編輯和基因功能研究中具有巨大的潛力。

畢赤酵母創新突破
經過幾十年的廣泛應用，畢赤酵母表達系統已成功表達了數以千計的異源蛋白，其中大部分為醫藥制品。美國FDA 對該系統的認可，如 Cephelon 制劑的獲批，充分證明了其安全性和有效性。在我國，雖然目前上市的基因工程藥物大多源于大腸桿菌原核表達系統，但畢赤酵母表達系統憑借其國際上的廣泛認可，必將在未來的醫藥市場中占據重要地位。

未來展望
畢赤酵母表達系統以其高表達、高密度、多樣化翻譯后修飾以及無內毒素和病毒的安全性等優勢，成為重組蛋白表達的優選平臺。CRISPR/Cas9等基因組編輯技術的應用將進一步推動該系統的發展，助力重組人源蛋白在生物醫藥、美容護膚等領域的研究和應用。

參考文獻
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